Summary
Cette méthode décrit la synthèse combinatoire du film polyanhydride biodégradable et bibliothèques nanoparticules et la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques.
Abstract
Polyanhydrides sont une classe de biomatériaux avec une excellente biocompatibilité et les capacités d'administration de médicaments. Même si elles ont été largement étudiés avec conventionnelle d'un échantillon-à-la-fois des techniques de synthèse, une étude plus récente à haut débit approche a été développée permettant la synthèse et le test des grandes bibliothèques de polyanhydrides 1. Cela facilitera l'optimisation plus efficace et processus de conception de ces biomatériaux pour la délivrance de médicaments et de vaccins. La méthode présentée dans ce travail décrit la synthèse combinatoire du film polyanhydride biodégradable et bibliothèques nanoparticules et la détection à haut débit de la libération de protéines à partir de ces bibliothèques. Dans ce procédé robot actionné (figure 1), des actionneurs linéaires et les pompes à seringue sont commandés par LabVIEW, qui permet à un protocole automatisé mains libres, ce qui élimine une erreur d'utilisateur. De plus, cette méthode permet la fabrication rapide de bibliothèques polymères micro-échelle, rougepremière utilisation de la taille du lot tout en conduisant à la création de systèmes de polymères multivariée. Cette approche combinatoire pour la synthèse de polymères facilite la synthèse de jusqu'à 15 différents polymères en une quantité équivalente de temps il faudrait pour synthétiser un polymère classique. En outre, la banque combinatoire de polymère peut être fabriqué dans des géométries vides ou protéine-chargé notamment des films ou des nanoparticules lors de la dissolution de la bibliothèque de polymère dans un solvant et précipitation dans un non-solvant (nanoparticules) ou par séchage sous vide (pour les films). Lors du chargement d'une protéine conjugué à un fluorochrome dans les bibliothèques de polymères, cinétique de libération de protéines peut être évalué à haut débit en utilisant une méthode de détection basée sur la fluorescence (figures 2 et 3) comme décrit précédemment 1. Cette plate-forme combinatoire a été validé avec des méthodes conventionnelles 2 et le film polyanhydride et les bibliothèques des nanoparticules ont été caractérisées par
Protocol
1. Combinatoire Polymer Bibliothèque de synthèse (variant en chimie des polymères) - voir Figure 1 pour l'installation robotisée
- Dissoudre chaque monomère dans le solvant approprié (concentration = 25 mg / ml) et charger chaque gaz dans une seringue étanche à 10cc.
- Fixer les tubes de verrouillage résistant aux solvants leurres capillaires à la fin de chaque seringue.
- Placez les seringues sur les pompes à seringues (New Era Pompes seringues programmables) et la verrouiller en position.
- Définir les actionneurs linéaires (Zaber) à la position de départ.
- Grâce aux pinces support universel, positionner l'extrémité des deux tubes capillaires dans le flacon de départ / puits pour le dépôt de monomère.
- Lancer le programme LabVIEW, qui pompe des volumes variables de chaque monomère dans chaque puits en fonction de la composition copolymère désirée. Ce résultat est obtenu en chargeant le programme de l'actionneur de l'axe Z pour abaisser les tubes capillaires dans le flacon / puits, puis chaque pompe pour distribuer le volume désiré. Next, le programme ordonne la Z-actionneur pour revenir à sa position d'origine et les X et Y actionneurs pour déplacer la position de la fiole suivante / puits. Ceci est effectué jusqu'à ce que chacun d'eux a bien le volume souhaité de monomère qui y sont déposées.
- Après le dépôt de monomère, la bibliothèque monomère multi-puits ou multi-flacon est transféré dans un four pré-chauffé sous vide et on incube sous vide pendant la durée de la réaction de polymérisation par condensation. Pour CPH: synthèse SA, la réaction est effectuée à 180 ° C, 0,3 torr, pendant 1,5 heures, mais ces conditions de réaction varient entre différents systèmes polymères.
2. Blank combinatoire et en protéines chargé de nanoparticules de polymère et de fabrication Cinémathèque - voir Figure 1 pour l'installation robotisée
- La seringue dans la pompe à seringue programmable première est rempli avec un solvant (bibliothèque vide) ou avec un solvant protéine dispersée dans celui-ci (protéine chargée en bibliothèque), tandis que la seringue dans la seconde seringuepompe reste vide. Des tubes pour la fabrication de nanoparticules dans le porte-échantillon adjacent sont remplies avec le non-solvant (rapport du solvant au non-solvant est de 1 à 100). Pour la fabrication de film d'un vide plaque multi-puits est utilisée à la place des tubes dans le porte-échantillon adjacent.
- En utilisant le programme LabVIEW, le solvant est déposé dans tous les flacons polymère / puits de la bibliothèque (= concentration de 20 mg / ml) et incubé pendant 1-5 min. Une étape de sonication en option (30 s à 40 Hz) peut être introduit pour assurer la dissolution complète de polymère.
- Ensuite, en lançant un programme distinct LabVIEW, l'échantillon est retiré dans la seringue vide, et déposé dans son tube correspondant de puits non-solvant (nanoparticules) ou vide (films) dans le porte-échantillon adjacent.
- Ce procédé est effectué pour chaque composition de polymère discrète de la bibliothèque.
- La nanoparticule ou de la bibliothèque de film est alors placé dans une chambre à vide pour l'élimination du solvant et de non-solvant (la balance des nanoparticulesry peut aussi être récupéré par filtration sous vide).
3. À haut débit cinétique de libération de protéines
- Pour étudier haut débit cinétique de libération de protéines à partir d'une bibliothèque polymère, un 96 profond jailli (2 ml / puits), plaque de polypropylène est modifiée de sorte que le 1/3 supérieur de la paroi du puits dans les colonnes voisines (ex: A et B, C et D, E et F, G et H) a été retirée pour se raccordent les puits. Les films de protéines chargées doivent être fabriqués dans des nanoparticules ou transférés dans cette plaque pour effectuer à haut débit libération études cinétiques. Échantillons de protéines chargé de nanoparticules ou de film ne doit être placé dans un puits des colonnes adjacentes (ex: A, C, E et G). Voir la figure 4 pour plus de détails.
- Après le transfert des nanoparticules à la plaque à 96 libération profonde jailli, les particules peuvent se déposer. Tampon PBS (0,1 mM, pH 7,4) est ajouté lentement à chaque puits d'échantillon (colonnes A, C, E et G), puis à chaque puits voisin (colonnes B, D, F et H) jusqu'à ce que les puits sont pleins et le tampon est à écoulement libre entre les puits adjacents. Pour les nanoparticules, ce processus doit être effectué avec prudence pour s'assurer que les particules restent au bas de l'échantillon et colonnes (A, C, E et G) et non transférées dans la version attenante bien (colonnes B, D, F et H). Dans certains cas, la centrifugation est nécessaire pour localiser des échantillons de nanoparticules au fond du puits d'échantillon (colonnes A, C, E et G).
- Ensuite, la plaque de séparation est fermée par un couvercle et placé à la température souhaitée (par exemple 37 ° C) sous agitation pendant la durée de l'expérience.
- À certains moments supplémentaires (soit 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 et 30 jours) le montant des libérés conjugué à un fluorochrome protéine est quantifié à l'aide d'un Typhoon 9400 Scanner à plat fluorescent ( GE Healthcare). La plaque de libération est placé sur la surface du scanner, numériser à l'aide du laser d'excitation et d'émission appropriés filters, et l'intensité de la fluorescence de la protéine libérée dans le puits de sortie (colonnes B, D, F et H) est quantifiée (Quant image). Il est suggéré que les normes de protéines de concentrations connues être inclus dans la plaque et pour le calcul de la quantité de protéines et de comptabilité pour la trempe fluorochrome.
4. Les résultats représentatifs
Lors de la fabrication de la bibliothèque de polymère, la caractérisation a été réalisée avec 1 H RMN, GPC, et FTIR pour valider cette méthode combinatoire 1,7,8,11. Moléculaire gamme de poids 10,000-20,000 g / mol, gammes indice de polydispersité de 1,5 à 3,0, et la composition chimique a été montré pour être précis et en accord avec les méthodes conventionnelles de 12-15 synthèse polyanhydride. De même, les images MEB des bibliothèques nanoparticules a montré une morphologie de surface similaire, la taille et distribution de taille que celle des nanoparticules fabriquées traditionnellement 2. Protéines communiqué kinetics à partir de nanoparticules de polyanhydride ou de films est effectué dans une plaque de puits à jour comme décrit précédemment 1. Les résultats ont révélé une libération d'ordre zéro approximative avec ou sans une rafale dépend de la charge en protéines et chimie des polymères (figures 2 et 3) 1,12,14,16.
Figure 1. Combinatoire film polymère et un appareil de fabrication de nanoparticules.
Figure 2 haut-débit libération de Texas Red sérum albumine bovine (TRBSA) à partir d'un CPH:. Bibliothèque SA nanoparticules de polymère. SA riches en chimies de polymère encapsulé TRBSA libérer le plus rapidement, alors que CPH-riches chimies de polymère libérer le plus lent. Les barres d'erreur représentent écart typetion et n = 4. Reproduit avec la permission de Petersen et al. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figure 3 à haut débit libération de Texas Red sérum albumine bovine (TRBSA) à partir d'un CPTEG:. Bibliothèque CPH film polymère. CPTEG riches en chimies de polymère encapsulé TRBSA libérer le plus rapidement, alors que CPH-riches chimies de polymère libérer le plus lent. Les barres d'erreur représentent l'écart type et n = 3.
Figure 4. Image montrant deux puits voisins "avant" et "après" modification de la plaque 96 en polypropylène profonde jailli. L'image "après" modification de droite représente également l'addition d'un film polymère (en bas à gauche du puits) avec une molécule fluorescente encapsuléed'être libéré entre les deux puits dans une solution tampon. La molécule libérée fluorescente est ensuite détectée dans le droit bien.
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Discussion
Connaissance des conditions de synthèse nécessaires et les températures de transition vitreuse (Tg) des polymères étant synthétisés sont indispensables pour la fabrication de la bibliothèque. Si la Tg est inférieure à la température ambiante, l'étape de fabrication de nanoparticules peuvent avoir besoin d'être effectuée dans un environnement à température contrôlée en dessous de la T g des polymères. En outre, des précautions doivent être prises pour s'assurer que tout le matériel qui entre en contact avec des températures élevées et les solvants doivent être aptes à gérer ces conditions. Plusieurs des paramètres de ce protocole peut être ajustée (par exemple, la température, sous vide, des temps d'incubation, les solvants, les non-solvants, de la concentration de polymère, taux de solvant à non solvant, etc) pour recevoir différents systèmes de polymères de synthèse ou des particules / film fabrication. Dans certains cas, les nanoparticules ne sont pas stables dans les solvants pour de longues périodes (suffisant pour l'élimination du solvant par séchage sous vide) de sorte que deux rem autre solvantModes d'ovale peut être utilisée. 1) Les particules peuvent être lentement centrifuge, le solvant surnageant est décanté et les particules restantes séché ou 2) des particules peut être séparé par filtration puis séché sous vide. Suite à la fabrication de nanoparticules vierges ou des protéines chargé / films à haut débit de caractérisation et les tests peuvent être effectués pour dépister les biomatériaux pour les protéines, cellulaire, ou les interactions hôte. Cette méthode à haut débit permet l'optimisation rapide des performances biomatériau pour l'application souhaitée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le prix ONR-MURI (NN00014-06-1-1176) et le US Army Medical Research et du matériel de commande (Grant No. W81XWH-10-1-0806) pour le soutien financier. Ce matériel est basé sur des travaux appuyés par le National Science Foundation Grant n ° 0552584 et 0851519 CEE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
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