Summary
Diese Methode beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken.
Abstract
Polyanhydride sind eine Klasse von Biomaterialien mit exzellenten Biokompatibilität Droge Lieferfähigkeit. Während sie wurden ausgiebig mit der studierten herkömmlichen Ein-Stichproben-at-a-time-Synthese-Technologien, eine neuere High-Throughput-Ansatz entwickelt ermöglicht die Synthese und Erprobung von großen Bibliotheken Polyanhydride 1. Dies erleichtert eine effizientere Optimierung und Design-Prozess dieser Biomaterialien für Drogen-und Impfstoff-Delivery-Anwendungen. Das Verfahren in dieser Arbeit beschreibt die kombinatorische Synthese von biologisch abbaubaren Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken und die Hochdurchsatz-Detektion von Protein-Freisetzung aus diesen Bibliotheken. In diesem Roboter betriebene Verfahren (Abbildung 1) werden lineare Aktuatoren und Spritzenpumpen von LabVIEW, die eine Freisprecheinrichtung automatisierten Protokoll ermöglicht, wodurch Anwenderfehler gesteuert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren die rasche Herstellung von Mikro-Maßstab Polymer Bibliotheken, rotenucing die Chargengröße während was zur Schaffung multivariante Polymersystemen. Diese kombinatorische Ansatz zur Synthese von Polymeren ermöglicht die Synthese von bis zu 15 verschiedene Polymere in eine äquivalente Menge an Zeit, die für ein Polymer konventionell synthetisieren würde. Darüber hinaus kann die kombinatorische Bibliothek in freilassen Polymer oder Protein-beladenen Geometrien einschließlich Filmen oder Nanopartikel beim Auflösen des Polymers Bibliothek in einem Lösungsmittel und Ausfällen in einem Nichtlöser (z. Nanopartikel) oder durch Vakuumtrocknung (für Folien) hergestellt werden. Nach dem Laden eines Fluorochrom-konjugierten Proteins in die Polymer-Bibliotheken kann Protein Freisetzungskinetik bei hohem Durchsatz untersucht werden mit Hilfe eines Fluoreszenz-basierten Detektionsverfahren (Abbildungen 2 und 3), wie zuvor beschrieben ein. Diese kombinatorische Plattform wurde mit konventionellen Methoden validiert wurden 2 und das Polyanhydrid Film-und Nanopartikel-Bibliotheken wurden mit geprägt
Protocol
Ein. Kombinatorische Polymer Library Synthesis (Wechselnde in Polymerchemie) - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup
- Aufzulösen jedes Monomer in dem geeigneten Lösungsmittel (Konzentration = 25 mg / ml) und jeweils in eine geladen 10cc gasdichte Spritze.
- Anbringen der lösemittelbeständigen Köder Sperre Kapillarröhren an das Ende jeder Spritze.
- Legen Sie die Spritzen auf den Spritzenpumpen (New Era Programmable Spritzenpumpen) und einrasten.
- Festlegen der Hubantriebe (Zaber) in die Ausgangsposition.
- Verwendung Ring Stativklemmen Positionieren des Endes der beiden Kapillarröhrchen in die Ausgangsstellung Fläschchens / Vertiefung für Monomer Abscheidung.
- Initiieren des LabVIEW Programm, das Pumpen variablen Volumina jedes Monomers in jede Vertiefung je nach der gewünschten Copolymerzusammensetzung. Dies wird in dem Programm durch Anweisen der Z-Achsen-Aktuator, um die Kapillarröhren in das Fläschchen / Vertiefung und dann jede Pumpe zu verringern, um das gewünschte Volumen abzugeben erreicht. Next, instruiert das Programm die Z-Stellglied in seine Ausgangsstellung und die X-und Y-Aktuatoren zurückzukehren, um zu der Position des nächsten Fläschchens / Vertiefung bewegen. Dies erfolgt, bis jede Vertiefung der gewünschte Volumen der Monomer abgeschieden hat hinein durchgeführt.
- Nach Monomer Abscheidung wird der Multi-Well-oder Mehrglasmethode Monomer Bibliothek, um eine vorgewärmte Vakuumofen überführt und unter Vakuum für die Dauer der Kondensationspolymerisationsreaktion. Für CPH: SA-Synthese wird die Reaktion bei 180 ° C, 0,3 Torr für 1,5 Stunden, aber diese Reaktionsbedingungen wird in den diversen Polymer-Systeme variieren.
2. Kombinatorische Blank und Protein-beladenen Polymer Nanopartikel und Film Library Fabrication - siehe Abbildung 1 für Robotic-Setup
- Die Spritze in der ersten programmierbaren Spritzenpumpe mit einem Lösungsmittel gefüllt (freilassen library) oder ein Lösungsmittel mit darin dispergierten Protein (Protein-beladenen Bibliothek), während die Spritze in der zweiten SpritzePumpe ist leer. Rohre zur Herstellung Nanopartikel in der benachbarten Probenhalter mit dem Nicht-Lösungsmittel gefüllt (Verhältnis von Lösungsmittel zu Nichtlösungsmittel 1 bis 100). Für Filmherstellung eine leere Multiwellplatte wird anstelle der Rohre in dem benachbarten Probenhalter verwendet.
- Verwendung des LabVIEW Programms wird das Lösungsmittel in alle Polymer Vials / Vertiefungen der Bibliothek (Konzentration = 20 mg / ml) abgeschieden und inkubiert für 1-5 min. Eine optionale Beschallungsschritt (30 s bei 40 Hz) eingeführt werden, um vollständige Polymerauflösung gewährleisten.
- Anschließend wird durch Einleiten einer separaten LabVIEW-Programm wird die Probe in die leere Spritze zurückgezogen und hinterlegt in seinem entsprechenden Röhre des Nichtlösungsmittels (Nanopartikel) oder leeren Vertiefung (Filme) in der benachbarten Probenhalter.
- Dieser Vorgang wird für jede Zusammensetzung des diskreten Polymer-Bibliothek durchgeführt wird.
- Das Nanopartikel oder Film-Bibliothek wird dann in einer Vakuumkammer für Lösungsmittel und Nicht-Lösungsmittel-Entfernung (das Nanopartikel libra platziertry können auch wieder mittels Vakuumfiltration werden).
3. High-throughput Protein Freisetzungskinetik
- Zur Untersuchung mit hohem Durchsatz Protein Freisetzungskinetik von einem Polymer Bibliothek, eine 96 tief welled (2 ml / Vertiefung) wird Polypropylen Platte modifiziert, dass die oberen 1/3 von der Bohrlochwand in benachbarten Säulen (Bsp.: A und B, C und D, E und F, G und H) wird entfernt, um die Vertiefungen angrenzen. Die Protein-beladenen Folien müssen hergestellt werden oder die Nanopartikel in diese Platte überführt, um mit hohem Durchsatz Freisetzungskinetik Versuche durchzuführen. Protein-beladenen Nanopartikel oder Filmproben muss nur in einer Vertiefung der angrenzenden Säulen (A, C, E, und G ex) abgegeben werden. Siehe Abbildung 4 für Details.
- Nach der Übertragung der Nanopartikel an die 96 tief welled Ausrückplatte werden die Partikel absetzen gelassen. PBS-Puffer (0,1 mM, pH 7,4) wird langsam zu jedem Probenbehälter (Spalten A, C, E und G) zugegeben und dann zu jedem benachbarten Schacht (Spalten B, D, F und H), bis die Vertiefungen gefüllt sind, und der Puffer ist frei fließend zwischen benachbarten Vertiefungen. Für Nanopartikel, muss dieser Prozess mit besonderer Vorsicht durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Partikel bleiben an der Unterseite der Probe gut (Spalten A, C, E und G) und nicht in den angrenzenden Release übertragen auch (Spalten B, D, F und H). In einigen Fällen wird Zentrifugieren erforderlich ist, um die Nanopartikel zu lokalisieren Proben am Boden des Probenbehälters (Spalten A, C, E und G).
- Als nächstes wird die Auslöseplatte mit einem Deckel verschlossen und bei der gewünschten Temperatur (dh 37 ° C) unter Rühren für die Dauer des Experiments.
- Bei inkrementellen Zeitpunkten (dh 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 und 30 Tage) die Menge des freigesetzten Fluorochrom-konjugiertem Protein wird quantifiziert unter Verwendung eines 9400 Typhoon Flachbett Fluorescent Scanner ( GE Healthcare). Die Freigabeplatte auf dem Scanner platziert ist, abgetastet mit der entsprechenden Laser-Anregung und Emission filters, und die Fluoreszenzintensität des freigesetzten Proteins in der Freigabestellung Vertiefungen (Spalten B, D, F und H) quantifiziert wird (Bild Quant). Es wird vorgeschlagen, dass Protein Standards bekannter Konzentration in der Well-Platte zum Berechnen Proteinmenge und Bilanzierung von Fluorochrom Abschrecken enthalten sein.
4. Repräsentative Ergebnisse
Bei der Herstellung der Polymer-Bibliothek, hat die Charakterisierung wurden mit 1 H-NMR, GPC und FTIR durchgeführt, um zu überprüfen diese kombinatorische Methode 1,7,8,11. Molekulargewichte reichen von 10.000-20.000 g / mol, Polydispersität Index reicht von 1,5 bis 3,0, und die chemische Zusammensetzung hat sich gezeigt, um genau zu sein und in Übereinstimmung mit konventionellen Methoden der Polyanhydrid Synthese 12-15. Ebenso zeigte SEM-Bilder der Nanopartikel Bibliotheken ähnliche Oberflächen-Morphologie, Größe und Größenverteilung als die von herkömmlich hergestellten Nanopartikeln 2. Protein Freisetzung kinetischcs aus Polyanhydrid Nanopartikel oder Filme erfolgt in einer modifizierten Lochplatte durchgeführt, wie zuvor beschrieben ein. Die Ergebnisse zeigten eine ungefähre Freisetzung nullter Ordnung mit oder ohne Burst abhängig Protein Be-und Polymerchemie (Abbildungen 2 und 3) 1,12,14,16.
Abbildung 1. Kombinatorische Polymerfilm und Nanopartikel Vorrichtung zum Herstellen.
Abbildung 2 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPH:. SA Polymernanopartikel Bibliothek. SA-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen Standardabweichungention und n = 4 ist. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Petersen et. al. ein. Copyright 2010 American Chemical Society.
Abbildung 3 Hochdurchsatzforschung Freisetzung von Texas Red Rinderserumalbumin (TRBSA) von einer CPTEG:. CPH Polymerfilm Bibliothek. CPTEG-reichen Polymer-Verbindungen freisetzen gekapselt TRBSA am schnellsten, während CPH-reiche Polymer-Chemie die langsamste freizugeben. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung und n = 3 ist.
Abbildung 4. Das Bild zeigt zwei benachbarte Brunnen "vor" und "nach" Änderung in der 96 tief welled Polypropylen-Platte. Das "nach" Modifikation Bild rechts zeigt auch die Zugabe eines Polymerfilms (unten links Vertiefung) mit einem gekapselten Fluoreszenzmolekülwobei zwischen den beiden Bohrungen in einer Pufferlösung gelöst. Das freigesetzte fluoreszierende Molekül wird dann in die richtige gut detektiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kenntnis der erforderlichen Synthesebedingungen und den Glasübergangstemperaturen (T g s) der Polymeren synthetisiert sind für Bibliothek Herstellung. Falls die T g s unter Raumtemperatur, so kann der Nanopartikel Herstellungsschritt, müssen unter einer kontrollierten Temperatur-Umgebung unterhalb der T g des Polymers durchgeführt werden. Darüber hinaus sollte mit Vorsicht getroffen werden, um sicherzustellen, dass alle Geräte, die in Kontakt mit hohen Temperaturen und die Lösungsmittel kommt, muss fit sein, um diese Bedingungen zu behandeln. Mehrere der Parameter dieses Protokolls kann eingestellt werden (dh Temperatur, Vakuum, Inkubationszeiten, Lösungsmittel, nicht-Lösungsmitteln, Polymerkonzentration, Lösungsmittel zu Nichtlösungsmittel Verhältnisse usw.) werden an verschiedene Polymersysteme zur Synthese oder Partikel / Film unterzubringen Fertigung. In einigen Fällen sind Nanopartikel nicht in Lösungsmitteln für lange Zeiträume stabil (ausreichend für die Lösungsmittelentfernung durch Vakuumtrocknung) so zwei alternative Lösungsmittel removalen Verfahren können verwendet werden. 1) Die Partikel können langsam zentrifugiert werden, der Überstand Lösungsmittel dekantiert und die verbleibenden Teilchen getrocknet oder 2) können die Partikel durch Vakuumfiltration abgetrennt und dann getrocknet. Nach der Herstellung des Rohlings oder Protein beladenen Nanopartikel / Folien, Hochdurchsatz-Charakterisierung oder Tests können durchgeführt werden, um die Biomaterialien für Protein, zellulären oder Wirt-Wechselwirkungen zu screenen. Diese High-Throughput-Methode ermöglicht die schnelle Optimierung von Biomaterial Leistung für die gewünschte Anwendung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen die ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) und die US Army Medical Research und Materiel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) für finanzielle Unterstützung. Dieses Material basiert auf der Arbeit von der National Science Foundation unter Grant No EWG 0552584 und 0851519 unterstützt werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
