Summary
Questo metodo descrive la sintesi combinatoria di film polianidride biodegradabile e le biblioteche delle nanoparticelle e l'high-throughput di rilevamento del rilascio di proteine da queste librerie.
Abstract
Polianidridi sono una classe di biomateriali con eccellente biocompatibilità e capacità di consegna della droga. Mentre sono stati studiati estesamente con convenzionale-campione-at-a-time tecniche di sintesi, una più recente high throughput approccio è stato sviluppato consentendo la sintesi e la verifica di grandi librerie di polianidridi 1. Ciò faciliterà l'ottimizzazione più efficiente e il processo di progettazione di questi biomateriali per applicazioni di rilascio di farmaci e vaccini. Il metodo in questo lavoro descrive la sintesi combinatoria di film polianidride biodegradabile e le biblioteche delle nanoparticelle e l'high-throughput di rilevamento del rilascio di proteine da queste librerie. In questo metodo roboticamente azionamento (figura 1), attuatori lineari e pompe a siringa sono controllati da LabVIEW, che consente un vivavoce protocollo automatizzato, eliminando errore dell'utente. Inoltre, questo metodo consente la rapida realizzazione di micro-scala librerie di polimeri, rossoucing la dimensione batch mentre conseguente creazione di sistemi polimerici multivariata. Questo approccio combinatorio per sintesi polimerica facilita la sintesi di fino a 15 differenti polimeri in una quantità equivalente di tempo necessario per sintetizzare un polimero convenzionale. Inoltre, la libreria combinatoria polimero possono essere realizzati in forme geometriche vuote o proteina-loaded compresi film o nanoparticelle di dissoluzione della biblioteca polimero in un solvente e precipitazione in un non-solvente (per nanoparticelle) o da essiccazione sotto vuoto (per i film). Una volta caricato un fluorocromo coniugato proteina nelle librerie di polimeri, cinetiche di rilascio di proteine può essere valutata a high-throughput usando un metodo basato sulla fluorescenza di rilevamento (figure 2 e 3) come descritto in precedenza 1. Questa piattaforma combinatoria è stato convalidato con metodi convenzionali 2 e il film polianidride e librerie nanoparticelle sono state caratterizzate con
Protocol
1. Combinatoria Polymer Synthesis Library (Variabile in Polymer Chemistry) - vedere la Figura 1 per l'installazione Robotic
- Sciogliere ogni monomero nel solvente appropriato (= concentrazione 25 mg / ml) e caricare ciascuna in una siringa a tenuta di gas 10cc.
- Collegare i solventi resistenti tubi capillari blocco esca alla fine di ciascuna siringa.
- Posizionare le siringhe sulle pompe siringa (Nuove pompe a siringa Era programmabili) e bloccare in posizione.
- Impostare gli attuatori lineari (Zaber) alla posizione di partenza.
- Con morsetti di stand anello, posizionare l'estremità dei due tubi capillari nel flaconcino di partenza / e per la deposizione di monomero.
- Avviare il programma LabVIEW, che pompa volumi variabili di ciascun monomero in ogni pozzetto a seconda della composizione del copolimero desiderato. Questo è realizzato nel programma istruendo l'asse Z dell'attuatore per abbassare i tubi capillari nel flaconcino / pozzetto e poi ogni pompa per erogare il volume desiderato. Next, il programma chiede Z-attuatore di ritornare nella posizione iniziale e le X e Y attuatori per spostare la posizione del flacone successivo / pozzetto. Questo viene effettuato fino ciascun pozzetto è il volume desiderato di monomero depositato in esso.
- Seguendo deposizione monomero, la libreria monomero multi-pozzetto o multi-fiala viene trasferito in un forno preriscaldato a vuoto e incubate sotto vuoto per tutta la durata della reazione di polimerizzazione per condensazione. Per CPH: sintesi SA la reazione è condotta a 180 ° C, 0,3 torr, per 1,5 ore, ma queste condizioni di reazione può variare tra i diversi sistemi polimerici.
2. Blank combinatoria e proteine-caricato nanoparticella polimerica e Biblioteca Fabrication Film - vedere la Figura 1 per l'installazione Robotic
- La siringa nella pompa a siringa prima programmabile è riempito con un solvente (biblioteca vuoto) o un solvente con proteine disperso in esso (proteina-loaded library) mentre la siringa nella seconda siringapompa viene lasciato vuoto. Tubi per fabbricazione nanoparticelle nel portacampioni adiacenti sono riempiti con il non-solvente (rapporto solvente non-solvente è da 1 a 100). Per la fabbricazione di una pellicola vuota piastra multipozzetto viene utilizzato al posto dei tubi nel supporto del campione adiacente.
- Utilizzando il programma LabVIEW, il solvente viene depositato in tutte fiale polimero / pozzetti della biblioteca (= concentrazione 20 mg / ml) e incubate per 1-5 min. Una fase opzionale sonicazione (30 s a 40 Hz) possono essere introdotte per garantire la completa dissoluzione del polimero.
- Successivo, avviando un programma separato LabVIEW, il campione viene prelevato nella siringa vuota, e depositato nel suo corrispondente tubo di ben non solvente (nanoparticelle) o vuoto (film) nel supporto del campione adiacente.
- Questo processo viene eseguito per ogni composizione della biblioteca discreta polimero.
- La libreria di nanoparticelle o film viene poi posto in una camera a vuoto per la rimozione del solvente e non solvente (il libra nanoparticellery può anche essere recuperato mediante filtrazione sotto vuoto).
3. High-throughput di proteine rilascio Cinetica
- Per indagare alto throughput cinetiche di rilascio di proteine da una libreria polimero, un 96-deep riempirono (2 ml / pozzetto), piastra di polipropilene viene modificato in modo tale che la parte superiore 1/3 della parete bene in colonne adiacenti (ex: A e B, C e D, E e F, G e H) viene rimosso per unire i pozzetti. La proteina-caricati i film devono essere fabbricati o le nanoparticelle trasferiti in questa piastra per eseguire high-throughput rilascio studi di cinetica. Protein-loaded nanoparticelle o film campioni devono essere immessi in un pozzetto delle colonne adiacenti (es: A, C, E e G). Vedere la Figura 4 per i dettagli.
- In seguito al trasferimento delle nanoparticelle al profondo sgorgava 96 piastra di rilascio, le particelle sono autorizzati a stabilirsi. Tampone PBS (0,1 mM, pH 7,4) viene lentamente aggiunto ad ogni pozzetto (colonne A, C, E e G) e quindi ad ogni confinante ben (colonne B, D, F, e H) fino a quando i pozzi sono pieni e il buffer è libero fluire tra pozzetti adiacenti. Per nanoparticelle, questo processo deve essere eseguita con estrema cautela per garantire le particelle rimangono sul fondo del pozzetto (colonne A, C, E e G) e non trasferito al rilascio adiacente pozzo (colonne B, D, F , e H). In alcuni casi, centrifugazione è richiesto di localizzare i campioni nanoparticelle sul fondo del pozzetto (colonne A, C, E e G).
- Successivamente, la piastra di rilascio è sigillato con un coperchio e posto alla temperatura desiderata (cioè 37 ° C) sotto agitazione per tutta la durata dell'esperimento.
- A tempi incrementali (cioè 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, e 30 giorni), la quantità di rilascio fluorocromo coniugato proteina è quantificato mediante un 9.400 Typhoon Scanner piano fluorescente ( GE Healthcare). La piastra di rilascio viene posto sulla superficie dello scanner, scansione con il laser appropriato eccitazione ed emissione filters, e l'intensità di fluorescenza della proteina rilasciata nel pozzetti rilascio (colonne B, D, F e H) viene quantificato (Quant immagine). Si suggerisce che la proteina standard di concentrazioni note essere inclusi nella piastra pozzo per calcolare la quantità di proteine e contabili per tempra fluorocromo.
4. Risultati rappresentativi
Sulla fabbricazione della biblioteca polimero, caratterizzazione è stata effettuata con 1 H NMR, GPC e FTIR per validare questo metodo combinatorio 1,7,8,11. Molecolare gamma di pesi da 10.000-20.000 g / mol, indice varia polidispersità 1,5-3,0, e la composizione chimica ha dimostrato di essere precisi e in accordo con i metodi convenzionali di sintesi polianidride 12-15. Analogamente, le immagini SEM delle librerie nanoparticelle mostrato morfologia di superficie simile, dimensioni e distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle come quella convenzionalmente fabbricate 2. Proteine rilascio kinetics da nanoparticelle polianidride o film viene effettuata in una piastra modificata così come descritto in precedenza 1. I risultati hanno rivelato un rilascio approssimativo di ordine zero, con o senza un burst dipendente dal carico di proteine e chimica dei polimeri (figure 2 e 3) 1,12,14,16.
Figura 1. Combinatoria pellicola polimerica e fabbricazione di apparecchi nanoparticelle.
Figura 2 High-throughput rilascio di Texas Red albumina di siero bovino (TRBSA) da un CPH:. SA biblioteca nanoparticella polimerica. SA-ricchi di composti polimerici rilasciare incapsulato TRBSA più rapidamente, mentre CPH ricchi di composti polimerici rilasciare il più lento. Le barre di errore rappresentano deviazione standardzione e n = 4. Ristampato con il permesso di Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figura 3 High-throughput rilascio di Texas Red albumina di siero bovino (TRBSA) da un CPTEG:. CPH biblioteca film polimerico. CPTEG ricchi di composti polimerici rilasciare incapsulato TRBSA più rapidamente, mentre CPH ricchi di composti polimerici rilasciare il più lento. Le barre di errore rappresentano deviazione standard ed n = 3.
Figura 4. Immagine che mostra due pozzi vicini "prima" e la modifica "dopo" nel profondo-sgorgava 96 lastra in polipropilene. L'immagine "dopo" modifica sulla destra rappresenta anche l'aggiunta di una pellicola di polimero (fondo del pozzo sinistra) con una molecola fluorescente incapsulatoessere rilasciato tra i due pozzetti in una soluzione tampone. La molecola fluorescente rilasciato viene quindi rilevato nella giusta bene.
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Discussion
Conoscenza delle necessarie condizioni di sintesi e le temperature di transizione vetrosa (T g s) dei polimeri viene sintetizzati sono essenziali per la fabbricazione library. Se la g T s sono sotto della temperatura ambiente, la fase di fabbricazione nanoparticelle può essere necessario effettuata in un ambiente a temperatura controllata inferiore del g T dei polimeri. Inoltre, si deve usare cautela per garantire che tutte le apparecchiature che viene a contatto con le alte temperature ei solventi devono essere in forma per gestire tali condizioni. Molti dei parametri di questo protocollo può essere regolata (cioè, temperatura, vuoto, tempi di incubazione, solventi, non solventi, concentrazione di polimero, solvente rapporti di non solvente, ecc) per ospitare diversi sistemi polimerici per sintesi o particelle / pellicola fabbricazione. In alcuni casi, le nanoparticelle non sono stabili in solventi per lunghi periodi di tempo (sufficiente per la rimozione del solvente da essiccazione sotto vuoto) così due rem alternate solventemetodi ovali possono essere utilizzati. 1) Le particelle possono essere centrifugati lentamente, il solvente sopranatante decantato, e le rimanenti particelle secche o 2) le particelle possono essere separati mediante filtrazione sotto vuoto e quindi essiccato. Dopo la fabbricazione di nanoparticelle vuote o proteina-caricato / film, high-throughput di caratterizzazione o degli esami può essere effettuata per schermare i biomateriali per proteine, cellulare, o interazioni host. Questo elevato throughput metodologia consente la rapida ottimizzazione delle prestazioni biomateriale per l'applicazione desiderata.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono l'ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) e l'US Army Medical Research e Materiel Command (Grant No W81XWH-10-1-0806) per il sostegno finanziario. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant No. CEE 0552584 e 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
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