Summary
स्थिर आइसोटोप लेबलिंग workflows रोजगार
Protocol
प्रस्तुत लियो workflows प्रोटीन की स्थिर आइसोटोप लेबलिंग हज़म और सिंथेटिक पेप्टाइड्स के लिए अनुमति देते हैं. ये समय बेशक प्रयोगों (1 चित्रा) तुलनात्मक और मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के रूप में के रूप में अच्छी तरह से protease अनुसंधान अध्ययन के लिए लागू कर रहे हैं. प्रत्येक वर्कफ़्लो दो प्रयोगात्मक (2 चित्रा) कदम के होते हैं: एक) संबंधित 18 हे स्थिर प्रतिक्रिया आइसोटोप इनकोडिंग (protease उत्प्रेरित पेप्टाइड दरार के हल नमूने समय, protease उत्प्रेरित carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया, एसिड उत्प्रेरित carboxyl ऑक्सीजन विनिमय ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री और 18 हे समावेश कैनेटीक्स की चित्रमय प्रतिनिधित्व के द्वारा और बी) विश्लेषण प्रतिक्रिया.
ए TimeCourse प्रयोग
मैं paleo - TimeCourse: proteolytic चोली की लेबलिंग Protease उत्प्रेरित
- (वैकल्पिक) (10 सुक्ष्ममापी) प्रोटीन और पेप्टाइड्स (250 सुक्ष्ममापी) के Disulfide बांड डीटीटी (अंतिम एकाग्रता 2.5 मिमी) के साथ कम कर रहे हैं25 मिमी में राष्ट्रीय राजमार्ग 4 3 HCO (दोनों हौसले से तैयार) 30 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा 50 डिग्री सेल्सियस
- (वैकल्पिक) मुफ्त cysteines iodoacetamide साथ alkylated कर रहे हैं (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी) 25 मिमी में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा राष्ट्रीय राजमार्ग 4 3 HCO.
- ब्याज की protease पर निर्भर करता है, प्रोटीन / पेप्टाइड समाधान को साफ - अप होने के लिए अवशिष्ट बफर और alkylation एजेंट को हटाने की जरूरत है. पेप्टाइड सफाई और Vivaspin केन्द्रापसारक concentrators (Sartorius) के लिए PepClean सी 18-स्पिन कॉलम (थर्मो) का उपयोग करने के लिए प्रोटीन के नमूने के लिए buffers का आदान - प्रदान.
- / Redissolve विनिमय पेप्टाइड्स / 20 μl protease प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन (ईसीई-1: 50 एमईएस KOH मिमी, 5.5 पीएच, trypsin: 25 मिमी एनएच 4 3 HCO, पीएच 8.0) (v / v) 01:01 अंतिम एच 2 युक्त हे 18 (95%, सिग्मा ISOTEC).
- एक बार शून्य बिंदु नमूना protease के अलावा करने से पहले वापस ले लें: मिक्स प्रतिक्रिया मिश्रण के 0.5 μl और 0.5 μl cyano-4-hydroxycinnamic अल्फाएसिड मैट्रिक्स (10/50% acetonitrile में मिलीग्राम मिलीग्राम, 0.1% TFA). Opti-TOF 384 के MALDI लक्ष्य प्लेट (अटल बिहारी SCIEX) पर नमूना स्पॉट और कमरे के तापमान पर विलायक बूंदों छोड़ जब तक सूखी (5 मिनट).
- दो aliquots में प्रतिक्रिया समाधान भाजित. कमरे या विशेष एंजाइम के लिए सिफारिश की तापमान तापमान: 1 अशेष भाजक ब्याज की protease (0.04 एनएम trypsin 75 एनएम ECE-1) के साथ incubated जाएगा. 2 अशेष भाजक protease बिना incubated जाएगा और नियंत्रण नमूना के रूप में काम करेंगे. 1 अशेष भाजक protease उत्प्रेरित 18 O लेबलिंग के लिए एक मानक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है और पेप्टाइड और प्रोटीन की पहचान, proteolytic गतिविधियों का पता लगाने और proteolytic दरार प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 2 अशेष भाजक दिखाने के लिए कि 18 O-समावेश protease द्वारा प्रेरित है करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसलिए न तो लेबलिंग और न ही दरार इस नमूने के लिए की उम्मीद है.
- प्रतिक्रिया aliquots हटाने और des के रूप में उन्हें खोलना प्रतिक्रिया का पालनसमय अंतराल पर 5 कदम के तहत cribed रूप में फिट लग रहे हैं. प्रतिक्रिया ऊपर वर्णित शर्तों चार दिनों (लगभग 24 स्पॉट) के लिए एक proteolytic प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए किया जाता है. 30 मिनट तक हर 5 मिनट नमूना शुरू, तो 8 घंटा और हर 8 घंटा तक 4 दिनों तक 2 घंटा तक हर 30 मिनट, तो हर घंटा हाजिर. विखंडन उत्पादों को पहले 12 घंटे के भीतर दिखाई और सब्सट्रेट पूरी तरह से hydrolyzed 24 घंटे के बाद होना चाहिए. विस्तारित प्रतिक्रिया ऊष्मायन बार प्रतिक्रिया मध्यवर्ती, जो आगे की कार्रवाई कर रहे हैं से असतत स्थिर प्रतिक्रिया उत्पादों को परिभाषित करने की अनुमति है. अनुसंधान प्रश्न और एंजाइम सब्सट्रेट जोड़े पर निर्भर करता है, समय और तापमान ऊष्मायन खोलना इष्टतम प्रतिक्रिया नमूना आश्वासन संग्राहक है.
- अंतिम प्रतिक्रिया समय बिंदु के बाद देखा है या विस्तारित खोलना अंतराल के बीच में, MALDI लक्ष्य प्लेट MALDI-TOF/TOF एमएस / एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जैसा कि नीचे वर्णित (धारा बी).
द्वितीय. Paleo TimeCourse: Postdigproteolytic टर्मिनी की estion लेबलिंग
- (वैकल्पिक) (10 सुक्ष्ममापी) प्रोटीन और पेप्टाइड्स (250 सुक्ष्ममापी) के Disulfide बांड 25 मिमी डीटीटी (अंतिम एकाग्रता 2.5 मिमी) के साथ एनएच 4 3 HCO (दोनों हौसले से तैयार) में कम कर रहे हैं 50 में 30 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए ऊष्मायन द्वारा
- (वैकल्पिक) मुफ्त cysteines iodoacetamide साथ alkylated कर रहे हैं (अंतिम एकाग्रता 10 मिमी) 25 मिमी में अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन द्वारा राष्ट्रीय राजमार्ग 4 3 HCO.
- ब्याज की protease पर निर्भर करता है, प्रोटीन / पेप्टाइड समाधान को साफ - अप होने के लिए अवशिष्ट बफर और alkylation एजेंट को हटाने की जरूरत है. पेप्टाइड और प्रोटीन बफर के आदान प्रदान के लिए सफाई Vivaspin केन्द्रापसारक concentrators के लिए PepClean C-18 स्पिन कॉलम का प्रयोग करें.
- Redissolve / साफ ऊपर पेप्टाइड उत्पादों / 20 μl protease प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन (जैसे trypsin: 25 मिमी एनएच 4 3 HCO, पीएच 8.0) का आदान - प्रदान और पूरा करने के लिए ब्याज की protease साथ डाइजेस्ट (जैसे trypsin: 0,04 एनएम, 37 डिग्री सेल्सियस, 12 घंटा).
- सफाई PepClean स्पिन C-18 कॉलम के साथ दरार उत्पादों. यह कदम अवशिष्ट protease गतिविधियों को समाप्त होगा.
- Redissolve / 20 μl protease प्रतिक्रिया बफर में साफ ऊपर पेप्टाइड उत्पादों का आदान - प्रदान (trypsin: 25 मिमी एनएच 4 3 HCO, पीएच 8.0) 01:01 (v / v) अंतिम एच 2 ओ 18 युक्त
- एक बार शून्य बिंदु नमूना एंजाइम के अलावा करने से पहले वापस ले लें: मिक्स प्रतिक्रिया मिश्रण और 0.5 μl अल्फा एसिड cyano-4-hydroxycinnamic मैट्रिक्स (50% acetonitrile में 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर, 0.1% TFA) के 0.5 μl. एक MALDI लक्ष्य प्लेट पर नमूना स्पॉट और कमरे के तापमान पर विलायक बूंदों सूखे तक छोड़ दो (5 मिनट के बारे में).
- दो aliquots में प्रतिक्रिया समाधान भाजित. कमरे या विशेष एंजाइम के लिए सिफारिश की तापमान तापमान में: 1 अशेष भाजक ब्याज की protease (0.04 एनएम जैसे trypsin) के साथ incubated जाएगा. 2 अशेष भाजक protease बिना incubated जाएगा और एक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे. पहलेअशेष भाजक protease उत्प्रेरित 18 लेबलिंग O-postdigestion के लिए एक मानक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है और पेप्टाइड और प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 2 अशेष भाजक protease द्वारा उत्प्रेरित है दिखाने के लिए कि 18 हे समावेश करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसलिए कोई लेबलिंग इस नमूने के लिए की उम्मीद है.
- प्रतिक्रिया aliquots हटाने और खोलना के रूप में उन्हें 7 कदम के तहत वर्णित द्वारा समय अंतराल पर प्रतिक्रिया का पालन करें.) के रूप में फिट लग रहे हैं. उदाहरण के लिए, हम शुरू करने के लिए 30 मिनट और हर 15 मिनट के लिए हर 5 मिनट देखा कि बाद carboxyl ऑक्सीजन विनिमय trypsin द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए.
- अंतिम प्रतिक्रिया समय बिंदु के बाद देखा है या विस्तारित खोलना अंतराल के बीच में MALDI लक्ष्य प्लेट MALDI-TOF/TOF एमएस / एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जैसा कि नीचे वर्णित (धारा बी).
III. Aleo TimeCourse: एसिड उत्प्रेरित carboxyl समूहों की लेबलिंग
- (V / v) 18 टी में पानी O समृद्ध 01:01 के साथ व्यक्तिगत पेप्टाइड्स (50 एनएम) सेतेवह उपस्थिति या 0.1% की अनुपस्थिति (नियंत्रण) (v / v) अंतिम trifluoroacetic एसिड (कुल मात्रा 30 μl).
- नमूना एक MALDI लक्ष्य पर सीधे साथ 0.5μl अल्फा एसिड cyano-4-hydroxycinnamic मैट्रिक्स (50% acetonitrile में 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर, 0.1% TFA) के द्वारा 48 दिनों के लिए प्रतिक्रिया दैनिक उत्पादों के मिश्रण के 0.5 μl अशेष भाजक सह खोलना थाली.
- खोलना अंतराल के बीच और MALDI-TOF/TOF विश्लेषण एमएस / एमएस के लिए अंतिम प्रतिक्रिया समय बिंदु के खोलना MALDI लक्ष्य प्लेट प्रस्तुत धारा बी के रूप में नीचे वर्णित के बाद
बी MALDI-TOF/TOF एमएस / एमएस डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण
- मास स्पेक्ट्रा एक 4800 MALDI TOF / TOF विश्लेषक (अटल बिहारी SCIEX) का अधिग्रहण कर रहे हैं.
- विश्लेषण करने से पहले, साधन पेप्टाइड मानकों की एक अधिकतम ± 50 पीपीएम और छह चोटियों की एक न्यूनतम संख्या के लिए मैच के बड़े पैमाने पर माप त्रुटि सहिष्णुता के साथ मिश्रण (अटल बिहारी SCIEX TOF / TOF उपकरणों के अंशांकन के लिए मास मानक किट) के साथ calibrated है.
- एमएस स्पेक्ट्रा (सामूहिक रेंजकदम एक स्वीकार्य 2,000 के आधार शिखर तीव्रता श्रेणी के साथ 50 आकार) - 45,000, 400 - 3800 - 4000 मी / z) एक समायोज्य लेजर (तीव्रता 3400 के साथ सकारात्मक आयन मोड का उपयोग कर तीन प्रतियों में अधिग्रहण कर रहे हैं. एकल शॉट के लिए उप स्पेक्ट्रा का अधिग्रहण कर रहे हैं, 400 कुल शॉट्स / स्पेक्ट्रम के साथ, 800 उप स्पेक्ट्रा के बाद प्रभाव में आने के शर्तों को रोकने का अधिग्रहण (पास या असफल) या 400 उप स्पेक्ट्रा पास स्वीकृति मापदंड. कम प्रचुर मात्रा में नमूने के मामले में या जटिल जैविक पृष्ठभूमि की उपस्थिति में एमएस सीमा का पता लगाने के निचले सिरे 800 मी / z करने के लिए उठाया जाना चाहिए. इसके अलावा, यह एक नमूना सफाई पहले कदम के रूप में या नियंत्रण रेखा जुदाई द्वारा वर्णित के साथ नमक और अन्य यौगिकों दखल हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- एमएस डेटा फ़ाइलें (फ़ाइलों T2D.) 4000 सीरीज एक्सप्लोरर डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से निर्यात कर रहे हैं और हमारी प्रयोगशाला घर में सूचना प्रणाली, जो शुभंकर वर्णक्रमीय प्रसंस्करण और चोटी का पता लगाने के लिए शराब खींचनेवाला सॉफ्टवेयर (मैट्रिक्स विज्ञान) का इस्तेमाल में आयात. समस्थानिक लिफाफेऔर 18 हे समावेश अनुपात स्वचालित रूप से एक एल्गोरिथ्म एक मेसन एट अल 12. द्वारा वर्णित है और हमारे 9 समूह द्वारा रूपांतरित करने के लिए इसी तरह का उपयोग करके निर्धारित deconvoluted वैकल्पिक रूप से कर रहे हैं, 13 ZoomQuant और 14 सांप के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर और उपकरण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर संकुल Xpress BioWorks (थर्मो फिशर साइंटिफिक) और शुभंकर शराब खींचनेवाला Quantitation Toolbox के रूप में (मैट्रिक्स विज्ञान) 18 O-प्रकार 15,16 डेटा deconvolute 18 हे समावेश अनुपात व्यक्ति पेप्टाइड आइसोटोप प्रजातियों के रिश्तेदार योगदान के रूप में व्यक्त किया जाता है (यानी, 16 युक्त पेप्टाइड्स कर सकते हैं. हे, 18 1 हे या 18 2 हे पूरे समस्थानिक लिफाफा).
- , प्रत्येक TimeCourse प्रयोग के लिए आणविक जनता (एम एच] +) के लिए सभी का पता चला पेप्टाइड प्रजातियों जुड़े एमएस डेटा फ़ाइलों से निकाले जाते हैं और एक 100 पीपीएम जन चौड़ाई में binned मूल्यों.
- एककम से कम तीन टी [एम एच] + एक बिन आबाद करने के लिए आवश्यक हो. ज्ञात substrates के मामले में, फ़िल्टर बिन सूची proteolytic दरार उत्पादों की एक सूची सब्सट्रेट पेप्टाइड अनुक्रम से भविष्यवाणी ExPASy FindPept 17 उपकरण (का उपयोग करने के लिए तुलना में है http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) और एक 200 पीपीएम जन की त्रुटि स्वीकृति सहिष्णुता.
- एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा दरार FindPept उपकरण और बिन मूल्यों है कि उनके साथ जुड़े 18 O-incorporations के लिए भविष्यवाणी उत्पादों की सभी जन मूल्यों के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं. एमएस / एमएस डेटा 1kV प्रतिक्षेपक सकारात्मक आयन मोड में 4800 MALDI विश्लेषक TOF / TOF अर्जित कर रहे हैं, 4200 की एक निश्चित लेजर तीव्रता और सीआईडी बंद मोड में गैस के साथ. 50 शॉट्स उप स्पेक्ट्रा प्रति एक यादृच्छिक पैटर्न में हाजिर प्रति 40 उप स्पेक्ट्रा 2,000 शॉट्स / हाजिर के एक कुल उपज का एक कुल का अधिग्रहण कर रहे हैं.
- एमएस / एमएस डेटा फ़ाइलें (फ़ाइलों T2D.) 4000 श्रृंखला विस्फोटक से निर्यात कर रहे हैंrer डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर और हमारी प्रयोगशाला घर में सूचना प्रणाली में आयात, चोटियों का पता चला है और एमएस / एमएस शिखर सूचियों इसी binned एमएस डेटा के साथ जुड़े रहे हैं.
- पेप्टाइड पहचान के लिए, एमएस / एमएस शिखर सूचियों SwissProt निम्न खोज मापदंडों के साथ शुभंकर खोज इंजन का उपयोग कर डेटाबेस के खिलाफ खोजा जाता है: कोई एंजाइम विशिष्टता, 150 पीपीएम अग्रदूत आयन और 0.2 दा टुकड़ा आयन मास tolerances.
- पेप्टाइड identifications अतिरिक्त विशेषता वाई सीरीज टुकड़ा आयनों भर में 18 हे समावेश पैटर्न की पुष्टि के रूप में Shevchenko एट अल द्वारा वर्णित डेटा एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर (अटल बिहारी SCIEX) का उपयोग कर सकते हैं मान्य होना 18.
वर्णक्रमीय समय और 18 हे समावेश भूखंडों के सी. तैयारी
वर्णक्रमीय समय भूखंडों: प्रत्येक प्रतिक्रिया समय बिंदु के लिए डाटा एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर से एमएस डेटा फ़ाइलों (फ़ाइलों T2D) के रूप में निर्यात कर रहे हैं का उपयोग कर एक ASCII फ़ाइलेंमैक्रो और डेटा विश्लेषण और ग्राफिक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (जैसे OriginLab द्वारा उत्पत्ति) में आयात और झरना भूखंडों (चित्रा 3) के रूप में प्रदर्शित किया.
18 भूखंडों O-समावेश: प्रत्येक binned पेप्टाइड दरार उत्पाद के लिए, व्यक्ति पेप्टाइड आइसोटोप प्रजातियों के सापेक्ष योगदान (16 ओ, 18 1 हे या 18 हे 2) सभी प्रतिक्रिया समय अंक भर में निकाले जाते हैं और समय के खिलाफ साजिश रची (4 चित्रा).
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Representative Results
हम कार्यप्रवाह Paleo-TimeCourse का इस्तेमाल करने के लिए गतिशील 18 हे पेप्टाइड दरार proteolytic एंजाइमों द्वारा उत्पन्न उत्पादों में स्थिर आइसोटोप के समावेश की निगरानी. दृष्टिकोण प्रस्तुत विभिन्न सब्सट्रेट और protease संयोजन के लिए अपेक्षाकृत proteolytic प्रसंस्करण रास्ते के अध्ययन के लिए एक बहुमुखी उपकरण है. Proteolytic प्रतिक्रियाओं प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम पर बार बार नमूना द्वारा प्रयोग Paleo-TimeCourse सब्सट्रेट और उत्पाद abundances समय हल फोटो और प्रसंस्करण विवरण प्रदान करता है. सह खोलना एक लक्ष्य प्लेट पर अम्लीय मैट्रिक्स समाधान के साथ नमूने को रोकता है enzymatic प्रतिक्रिया और मैट्रिक्स crystallization आगे नमूना संरचना को बरकरार रखता है. इसलिए, समय अंक retrospectively enzymatic प्रतिक्रिया के समापन के बाद MALDI-TOF/TOF एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया जा. इन प्रयोगात्मक workflows के डेटा अमीर प्रकृति को समायोजित करने के लिए, हम एक अर्द्ध स्वचालित bioinformatics प्रणाली है कि 18 हे incorporat गणना लागूप्रत्येक पेप्टाइड चित्रा 3 के लिए आयन अनुपात एक प्रतिनिधि ECE-1 द्वारा पेप्टाइड Endokinin सी के प्रसंस्करण के वर्णक्रमीय समय बेशक साजिश को दर्शाता है. Paleo-TimeCourse डेटा बहुआयामी है: पूरे बड़े पैमाने पर सीमा के पार एमएस डेटा के विस्तृत दृश्य एक साथ पेप्टाइड सब्सट्रेट के abundances के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पेप्टाइड उत्पादों की abundances से पता चलता है. अस्थायी व्यवस्था दरार घटनाओं के अनुक्रम का गूढ़ रहस्य की अनुमति देता है और जो निर्धारित पेप्टाइड टुकड़े स्थिर दरार उत्पादों रहे हैं. zoomed एमएस डेटा के दृश्य में प्रत्येक पेप्टाइड आइसोटोप लिफाफे और दरार प्रेरित 18 O लेबलिंग इसकी विशेषता आइसोटोप वितरण द्वारा आसानी से पहचाना जाता है. 18 O लेबलिंग / एमएस द्वारा बाद में पहचान के लिए दरार उत्पादों की सकारात्मक चयन के लिए अनुमति देता है पता चलता है एमएस. कुल मिलाकर, परख Paleo TimeCourse proteolytic प्रसंस्करण की गतिशीलता को दर्शाता है और proteases की पसंदीदा दरार साइटों के मूल्यांकन की अनुमति देता है. अभी तक सूचना के एक अन्य स्तर परtion का उपयोग protease के enzymatic तंत्र के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है. सेरीन protease trypsin के रूप में इस तरह के कुछ proteases covalently उनके पेप्टाइड दरार उत्पादों rebinding में सक्षम हैं. सी टर्मिनल carboxyl समूह में एक 2 18 O परमाणु के समावेश में एसाइल एंजाइम मध्यवर्ती परिणामों की hydrolysis चित्रा 4 समय पर विभिन्न isotopomers के सापेक्ष योगदान में जिसके परिणामस्वरूप बदलाव से पता चलता है: प्रारंभिक पेप्टाइड बंधन दरार प्रतिक्रिया 16 हे और 18 हे 1 पेप्टाइड fractions के बीच एक 1:1 विभाजन में परिणाम है. carboxyl 16 हे अंश की एक सहवर्ती कमी के साथ संतुलन में 25% अनुपात 18 ओ 2 अंश की वृद्धि में ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया का परिणाम है. Carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करने में सक्षम proteases इसलिए एक अतिरिक्त 18 कार्यप्रवाह O लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, proteolytic आतंकवाद के postdigestion लेबलिंगमिनी. प्रयोगों के इन प्रकार में, substrates शुरू में 18 हे, पेप्टाइड उत्पादों साफ और protease के एक ताजा बैच के साथ incubated 2 एच के अभाव में पच जाता है, लेकिन 50% की उपस्थिति में इस समय 2 एच 18 ओ चित्रा 4 से पता चलता है आइसोटोप समावेश में मतभेद है कि इन दो प्रयोगात्मक workflows और व्यक्ति पेप्टाइड substrates के बीच निगमन गति में मतभेद में देखा जा सकता है. Postdigestion लेबलिंग कार्यप्रवाह में, दोनों 18 हे incorporations लिए दर carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया द्वारा निर्धारित किया जाता है. प्रतिक्रिया की दर आसानी से कैसे protease अपने दरार उत्पादों के साथ सूचना का आदान प्रदान पर निर्भर करता है. प्रतिक्रिया उत्पाद के लिए आत्मीयता परोक्ष रूप से मूल पेप्टाइड सब्सट्रेट protease के संबंध अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तरह की जानकारी निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो सकता है जो पेप्टाइड दृश्यों मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स अध्ययन में tryptic हज़म उदाहरण के लिए आदर्श substrates हैं सकता है. पीकि आसानी से और cleaved trypsin द्वारा डबल लेबल eptides के लिए proteotypic पेप्टाइड्स कि reproducibly और मात्रात्मक का गठन कर रहे हैं और इसलिए आदर्श तुलनात्मक प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकता है की संभावना है.
कम पीएच, जलीय विलायक 19-20 साथ कार्बोक्जिलिक एसिड समूहों की oxygens विनिमय. यह प्रतिक्रिया protease उत्प्रेरित रणनीतियों लेबलिंग पेप्टाइड्स में स्थिर आइसोटोप का परिचय करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. (एसिड उत्प्रेरित लेबलिंग 18 हे समृद्ध पानी रोजगार) Aleo TimeCourse कार्यप्रवाह में, हम सिंथेटिक पेप्टाइड्स में O-परमाणुओं में से 18 की धीमी समावेश पर नजर रखी. ऑक्सीजन एसिड उत्प्रेरित विनिमय MALDI लक्ष्य प्लेट पर मैट्रिक्स समाधान, प्रभावी ढंग से आइसोटोप वितरण राज्य "ठंड" के साथ सह crystallization के बाद बंद कर दिया. हम एक मॉडल पेप्टाइड Angiotensin 1 इस्तेमाल किया और अपने समय के साथ आइसोटोप लिफाफा (5 चित्रा) की जांच की. प्रत्येक कार के लिए दो 18 हे परमाणुओं के एक तेजboxyl समूह मनाया गया. वर्तमान प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, एसिड उत्प्रेरित carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया protease उत्प्रेरित 9 विनिमय की तुलना में बहुत धीमी थी और 48 दिनों के बाद ही संतुलन पर पहुंच गया. हालांकि, Aleo दृष्टिकोण पेप्टाइड्स कि proteases से मान्यता प्राप्त नहीं हैं लेबलिंग का लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, पेप्टाइड्स कई 18 अम्लीय पक्ष श्रृंखला है, जो unlabeled और लेबल प्रजातियों के आइसोटोप लिफाफे के पूर्ण जुदाई में परिणाम कर सकते हैं की संख्या पर निर्भर करता है हे - परमाणुओं शामिल. समग्र जन बदलाव एक भी पेप्टाइड में अम्लीय अवशेषों की संख्या के बारे में जानकारी प्रदान करता है और उनके स्थान एमएस / एमएस टुकड़ा आयन मास पारियों में से एक विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है 18 हे लेबल पेप्टाइड्स समान अपने unlabeled समकक्षों के रूप में chromatographic व्यवहार, के पास प्रदर्शित जो समान क्षालन समय में अपने तुलनात्मक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. सारांश में, एसिड उत्प्रेरित 18 हे लेबलिंग रासायनिक, एन के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैंzymatic और चयापचय लेबलिंग मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स में आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण. इस तकनीक का एक विशेष होनहार आवेदन स्थिर आइसोटोप मानकों के रूप में 18 हे लेबल पेप्टाइड्स का उपयोग है.
चित्रा 1. 18 लेबलिंग हे आधारित समय बेशक workflows की एक किस्म प्रदान करता है. (मैं) protease उत्प्रेरित कार्यप्रवाह Paleo-TimeCourse proteolytic दरार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता की निगरानी के लिए अनुमति देता है. Protease पर निर्भर करता है, (एक) (जैसे कुछ metalloproteases के मामले में) एक या (ख) डबल हे 18 समावेश कुछ सेरीन proteases के मामले में (उदाहरण के लिए). (द्वितीय) 18 डबल हे लेबलर ऐसे में इन प्रतिक्रियाओं परिणाम trypsin के रूप में भी postdigestion लेबलिंग workflows में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें 18 हे समावेश केवल protease उत्प्रेरित द्वारा मध्यस्थता हैcarboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया (iii) इसके विपरीत, कार्यप्रवाह Aleo TimeCourse एसिड उत्प्रेरित अम्लीय पेप्टाइड पक्ष और टर्मिनल समूहों की carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. Paleo और Aleo TimeCourse रणनीतियों के प्रायोगिक workflows. ए) (मैं) एक protease उत्प्रेरित प्रयोग Paleo TimeCourse, substrates 2 एच की उपस्थिति में एक protease के साथ incubated हैं 18 अप करने के समावेश में दो O-परमाणुओं 18 protease पर निर्भर करता है जिसके परिणामस्वरूप हे. (द्वितीय) एक paleo postdigestion लेबलिंग प्रयोग में, पिछले एक पाचन से दरार उत्पादों के साथ फिर से incubated 18 ओ 2 एच की उपस्थिति में ब्याज की एक protease डबल लेबलिंग (कार्यप्रवाह मैं में) करने में सक्षम proteases दो 18 हे परमाणुओं के समावेश को उत्प्रेरित करेगा. (Iii) एक एसिड उत्प्रेरित Aleo प्रयोग में, 18 हे अम्लीय सभी कार्य समूहों परमाणुओं बी) TimeCourse विश्लेषण शामिल:. समय अंतराल पर प्रतिक्रिया मिश्रण की aliquots MALDI लक्ष्य प्लेटों पर मैट्रिक्स के साथ सह देखा पर MS डाटा अधिग्रहण, पेप्टाइड दरार प्रतिक्रियाओं के वर्णक्रमीय समय भूखंडों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत पेप्टाइड प्रजातियों में से 18 हे समावेश भूखंडों उत्पन्न कर रहे हैं और दरार उत्पादों एमएस / एमएस आधारित अनुक्रम पहचान के लिए चुना जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 3. वर्णक्रमीय समय भूखंडों proteolytic दरार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता Paleo-TimeCourse प्रयोगों की एक झरना व्यवस्था में एमएस स्पेक्ट्रा की साजिश रचने से प्रदर्शित करते हैं, तो यह संभव है कि एक साथ सब्सट्रेट और मध्यवर्ती और अंतिम विपाटन उत्पादों के उद्भव की गिरावट की निगरानी. यहाँ, bioactive पेप्टाइड Endokinin सी की दरार endothelin परिवर्तित एंजाइम 1 (ईसीई-1) दिखाया गया है. विखंडन उत्पादों एमएस / एमएस और उनके आइसोटोप लिफाफे विशेषता 18 हे समावेश हस्ताक्षर (लाल रंग में हाइलाइट) प्रदर्शित की पहचान की गई.
चित्रा 4. Trypsin के रूप में इस तरह के सेरीन proteases दो पेप्टाइड दरार उत्पादों में 18 O-परमाणुओं अप करने के लिए समावेश मध्यस्थता. (मैं) लेबलिंग protease-आधारित कार्यप्रवाह ट्रोंग>, एक 50% एकल हौसले से उत्पन्न पेप्टाइड दरार उत्पादों (काले डॉट्स unlabeled, लाल एकल लेबल पेप्टाइड fractions से संकेत मिलता है) के लिए 18 हे समावेश अनुपात में पेप्टाइड बंधन दरार प्रतिक्रिया परिणाम. Proteases कि उनकी प्रतिक्रिया उत्पादों (जैसे trypsin के रूप में सेरीन proteases) rebind आगे carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया (हरी डॉट्स, डबल लेबल पेप्टाइड अंश) के माध्यम से एक दूसरे 18 हे परमाणु के समावेश उत्प्रेरित. संतुलन, 0.25:0.5:0.25 का एक लेबल वितरण (संयुक्त राष्ट्र, एकल, डबल लेबल) तक पहुँच जाता है में proteolytic टर्मिनी कार्यप्रवाह के postdigestion लेबलिंग (द्वितीय), कोई पेप्टाइड बांड चोली होते हैं. इसके बजाय, अप करने के लिए दो 18 हे परमाणुओं के लिए विशेष रूप से समावेश carboxyl ऑक्सीजन विनिमय प्रतिक्रिया पर आधारित है. इसलिए, 18 हे समावेश proteases कि उनके पेप्टाइड दरार उत्पादों rebind के साथ ही होता है.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. एसिड उत्प्रेरित 18 O लेबलिंग दो carboxyl समूह प्रति 18 हे परमाणुओं के समावेश होता है प्रयोग के दौरान, Angiotensin-1 के समस्थानिक लिफाफा कई दो दा द्रव्यमान (धराशायी लाइनों) तेज करने के लिए इसी बदलाव लिया. 18 हे परमाणुओं की. 18 हे समावेश साइटों अमीनो एसिड अनुक्रम (नीला) में डाला जाता है.
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Discussion
स्थिर आइसोटोप लेबलिंग और एक समय हल तरीके से उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन, paleo - TimeCourse विधि पेप्टाइड उत्पादों की पीढ़ी के एक गतिशील विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. परख मात्रात्मक और गुणात्मक प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए स्थिर isotopically लेबल पेप्टाइड्स उत्पन्न करने के लिए और कैनेटीक्स जो द्वारा proteotypic पेप्टाइड्स उत्पन्न कर रहे हैं, का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, Paleo TimeCourse विशिष्ट, physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों पूर्व vivo तहत proteolytic रास्ते का मूल्यांकन करने के लिए बनाया गया है अंतर्जात प्रोटीन, पेप्टाइड्स और proteases के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सिंथेटिक पेप्टाइड्स और पुनर्योगज proteases कार्यप्रवाह में उपयोग किया जा सकता है. विशेष रूप से जांच की जा proteolytic प्रतिक्रिया, परख की स्थिति और खोलना समय के आधार पर प्रतिक्रिया प्रक्रिया के इष्टतम नमूना लेने के लिए उपलब्ध कराने के लिए समायोजित किया जा सकता है. हमारे अनुभव में, यह उपयोगी है proteolytic प्रतिक्रियाओं को धीमा (जैसे कम एंजाइम सांद्रता का उपयोग करके, कमरे) तापमान सुविधाजनक पुस्तिका नमूना अंतराल के लिए अनुमति देने के लिए अन्य स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के तरीके के साथ की तरह, प्रयोगात्मक 18 हे समावेश अनुपात माप के लिए विचलन छोटे हैं पर्याप्त आयन आँकड़ों के साथ चोटियों के लिए आम तौर पर कम से कम 5%. समग्र प्रोटोकॉल आसानी से परख के अन्य प्रारूपों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कृत्रिम substrates के एक बड़े सेट या अंतर्जात पेप्टाइड्स के जटिल जैविक नमूने (जैसे, सेल संस्कृति मीडिया, शरीर के तरल पदार्थ) से proteolytic प्रसंस्करण के लक्षण वर्णन की स्क्रीनिंग. हम पहले दिखा दिया कैसे एक LC-जुदाई के साथ कदम Paleo दृष्टिकोण बंटे किया जा सकता है, और मानव लार peptidome 9 के गतिशील संरचना को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता proteolytic Paleo-TimeCourse द्वारा की पहचान हस्ताक्षर protease की सब्सट्रेट विशिष्टता के बारे में महत्वपूर्ण तथ्य प्रदान. ब्याज की. इसके अलावा, समय हल डेटा भी गतिज जानकारी पैदावार. ऐसे ज्ञान मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स अध्ययन, जहां प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और बहुत ही प्रचुर मात्रा पेप्टाइड्स लक्ष्य का चुनाव आवश्यक है 21 के लिए proteotypic पेप्टाइड्स के मूल्यांकन में विशेष रूप से उपयोगी है. इसी तरह, proteolytic रास्ते में कदम दर सीमित की पहचान उपन्यास protease आधारित दवाओं के विकास के लिए उच्च ब्याज की है. Proteases कई शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं (जैसे हृदय रोग, neurodegenerative रोगों, कैंसर) और इस तरह की टिप्पणियों को उपचारात्मक उपायों के लिए नए अवसर पैदा कर सकते में महत्वपूर्ण कारक हैं. Aleo रणनीति - एसिड उत्प्रेरित carboxyl समूहों की लेबलिंग आसानी से सिंथेटिक और अंतर्जात पेप्टाइड्स स्थिर isotopically इनकोडिंग मानकों उत्पादन करने के लिए लागू किया जाता है. एसिड उत्प्रेरित प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स ज्यादा एंजाइम उत्प्रेरित प्रतिक्रिया की तुलना में धीमी है. इसलिए, प्रयोगों के लिए सावधानी से आगे की योजना बनाई जाना है. Aleo TimeCourse एक कम लागत वैकल्पिक करने के लिए रसायन, चयापचय और सिंथेटिक लेबलिंग मीटरethods वर्तमान में प्रोटिओमिक्स अध्ययन में प्रयोग किया जाता है. लेबलिंग प्रक्रिया के लिए मान्य है कि 18 हे समावेश संतुलन है, जो अन्य स्थिर आइसोटोप लेबलिंग तरीकों पर एक लाभ हो सकता तक पहुँच के लिए नजर रखी जा सकती है. अंत में, लियो - TimeCourse workflows यहाँ वर्णित बहुमुखी उपकरण है कि रचनात्मक कई गुणात्मक और मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से protease अनुसंधान में नियोजित किया जा सकता हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH / NIDCR 1R01DE019796 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
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