مهام سير العمل صفها البروتيني وحمض حفز توظيف-<sup> 18</sup> O-المخصب المياه
Summary
وضع العلامات النظائر المستقرة العمل توظيف<sup> 18</sup> O-المخصب المياه (LEO-سير العمل) هي أدوات متعددة للدراسات البروتيوميات الكمية والنوعية. في العمل بمساعدة الأنزيم البروتيني (باليو)،<sup> 18</supيتم إدخال> O-ذرات من الانقسام والكربوكسيل بروتين تفاعلات تبادل الأكسجين بوساطة البروتياز. في سير العمل (اليو) حمض المحفزة،<sup> 18</supيتم إدخال> O-ذرات الأكسجين عن طريق تبادل الكربوكسيل في انخفاض الرقم الهيدروجيني.
Abstract
النظائر المستقرة هي أدوات أساسية في مطياف الكتلة البيولوجية. تاريخيا، تم 18 O-النظائر المستقرة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة آليات الحفاز من الإنزيمات المحللة للبروتين 1-3. مع ظهور البروتيوميات الطيف القائم الشامل، أصبح إدماج إنزيمي المحفزة من 18 ذرات من O-مستقر الماء المخصب isotopically وسيلة شعبية لمقارنة مستويات بروتين تعبير كميا (مراجعتها من قبل Fenselau وياو 4، مياجي وراو 5 و يي وآخرون 6). 18 O وضع العلامات تشكل بديلا بسيطة ومنخفضة التكلفة للمواد الكيميائية (مثل iTRAQ، ICAT) والتمثيل الغذائي تقنيات الوسم (على سبيل المثال SILAC) 7. اعتمادا على الأنزيم البروتيني المستخدمة، يمكن وضع العلامات 18 O يؤدي إلى إدماج تصل إلى ذرات منهما 18-O في المجموعة C-الكربوكسيل محطة للمنتج الانقسام 3 </sup>. ويمكن تقسيم رد الفعل العلامات إلى قسمين عمليات مستقلة، والانقسام ببتيد السندات وتبادل الأكسجين الكربوكسيل رد فعل 8. لدينا في باليو (ع rotease-A abeling ل ه ssisted mploying 18 O التخصيب الماء) تكييف الأنزيمية 18 O وضع العلامات، ونحن تستخدم 50٪ 18 O-المخصب لانتاج المياه التوقيعات النظائر مميزة. بالاشتراك مع عالية الدقة بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز التأين وقت من رحلة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب (MALDI-TOF/TOF MS / MS)، يمكن استخدام المغلفات النظائر لتحديد المنتجات المميزة الانقسام مع مستوى عال من الدقة. ونحن قد استخدمت سابقا باليو-منهجية لكشف وتميز البروتياز الذاتية 9 و رصد ردود بروتين 10-11. منذ باليو بترميز جوهر رد الفعل الانقسام بروتين، والإعداد التجريبية هو enri بسيطة والكيمياء الحيويةيمكن الخطوات chment من المنتجات الانقسام التحايل. يمكن بسهولة باليو-الأسلوب أن تمتد إلى (ط) التجارب بالطبع الوقت الذي رصد لديناميات تفاعلات الانقسام وبروتين (ب) تحليل العينات البيولوجية في التحلل البروتيني المعقد الذي يمثل الظروف الفسيولوجية. باليو-TimeCourse تجارب مساعدة في تحديد خطوات المعالجة معدل منظم للتفاعل وسيطة في مجمع ردود الفعل مسار بروتين. وعلاوة على ذلك، فإن رد فعل باليو تتيح لنا التعرف الإنزيمات المحللة للبروتين مثل التربسين سيرين البروتياز قادر إلى rebind المنتجات الانقسام وتحفيز إدماج في 18 2 O-ذرية. ويمكن استخدام مثل هذه "انقر نقرا مزدوجا وضع العلامات" الانزيمات لpostdigestion 18 O وضع العلامات، والتي وصفت حصرا الببتيدات عن طريق تفاعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل. استراتيجية الثالث من عمرنا يمتد وصفها توظيف 18 O التخصيب خارج المياه الانزيمات ويستخدم الرقم الهيدروجيني الحمضية الظروف لإدخال 18 علامة النظائر مستقرة O-atures في الببتيدات.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال الجمع بين النظائر المستقرة وضع العلامات وعالية الدقة قياس الطيف الكتلي بطريقة حلها في الوقت، وطريقة باليو-TimeCourse يسمح لتحليل ديناميكية من الجيل من المنتجات الببتيد. ويمكن استخدام الفحص لتوليد مستقرة الببتيدات المسمى isotopically للدراسات البروتيوميات الكمية وال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR المنح 1R01DE019796.
Materials
| Name of material | Company | Catalogue number |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX |
Table 1. Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 |
Table 2. Reagents
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application “ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -. J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid ‘de novo’ peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
