Summary
Stabile isotopen merking arbeidsflyt ansette
Abstract
Stabile isotoper er viktige verktøy i biologisk massespektrometri. Historisk, har 18 O-stabile isotoper blitt mye brukt for å studere de katalytiske mekanismer av proteolytiske enzymer 1-3. Med bruk av massespektrometri-baserte proteomikk, har enzymatisk-katalysert inkorporering av 18 O-atomer fra stabil isotopically beriket vann blitt en populær metode for å kvantitativt sammenligne protein expression nivåer (gjennomgått av Fenselau og Yao 4, Miyagi og Rao 5 og Ye et al. 6). 18 O-merking utgjør en enkel og rimelig alternativ til kjemisk (f.eks iTRAQ, ICAT) og metabolske (f.eks SILAC) merkingsteknikker 7. Avhengig proteasen utnyttet, kan 18 O-merking resultere i inkorporering av opptil to 18 O-atomer i den C-terminale karboksylgruppe av spaltningsprodukt 3 8 reaksjon. I vår Paleo (p rotease-en ssisted l abeling e mploying 18 O-beriket vann) tilpasning av enzymatisk 18 O-merking, benyttet vi 50% 18 O-beriket vann for å gi særegne isotop signaturer. I kombinasjon med høy oppløsning matrise-assistert laser desorpsjon ionisering time-of-flight tandem massespektrometri (Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS), kan de karakteristiske isotop konvoluttene brukes til å identifisere spaltningsproduktene med et høyt nivå av spesifisitet. Vi tidligere har brukt Paleo-metode for å påvise og karakterisere endogene proteaser 9 og overvåke proteolytiske reaksjoner 10-11. Siden Paleo koder selve essensen av den proteolytiske spalting reaksjon, er det eksperimentelle oppsettet enkelt og biokjemiske enrichment trinn spaltningsproduktene kan omgås. Paleo-metoden kan lett utvides til (i) tidsforløp eksperimenter som overvåker dynamikken proteolytisk spaltning reaksjoner og (ii) analyse av proteolyse i komplekse biologiske prøver som representerer fysiologiske betingelser. Paleo-tidsforløpet eksperimenter hjelp til å identifisere hastighetsbegrensende behandling trinn og reaksjon mellomprodukter i komplekse proteolytiske bane reaksjoner. Videre tillater paleo-reaksjonen oss å identifisere proteolytiske enzymer som serinprotease trypsin som er i stand å binde sine spaltningsproduktene og katalysere inkorporering av en andre 18 O-atom. Slike "dobbel merking" enzymer kan brukes for postdigestion 18 O-merking, hvor peptidene er utelukkende merket ved karboksylsiden oksygen utveksling reaksjon. Vår tredje strategien strekker merking ansette 18 O-beriket vann utover enzymer og bruker sure pH-forhold til å innføre 18 O-stabile isotoper tegnatures inn peptider.
Protocol
De presenterte Leo-arbeidsflyter tillate stabile isotoper merking av protein fordøyer og syntetiske peptider. Disse tidsforløpet eksperimenter (figur 1) er gjeldende for komparative og kvantitative proteomikk studier samt protease forskning. Hver arbeidsflyt består av to eksperimentelle trinn (figur 2): A) Tiden løst prøvetaking av respektive 18 O-stabil isotop-kodet reaksjon (protease-katalyserte peptid cleavage; protease-katalyserte karboksyl oksygen utveksling reaksjon; syrekatalysert carboxyl oksygen utveksling reaksjon) og B) analyse ved massespektrometri og grafisk representasjon av 18 O-innlemmelse kinetikk.
A. tidsforløpet Eksperimenter
I. Paleo-tidsforløpet: Protease-katalysert merking av proteolytiske cleavages
- (Valgfritt) disulfidbindinger av proteiner (10 pM) og peptider (250 mikrometer) er redusert med DTT (endelig konsentrasjon 2,5 mm)i 25 mM NH 4 HCO 3 (begge ferskt tilberedte) ved inkubering i 30 minutter ved 50 ° C.
- (Valgfritt) Free cysteinene er alkylert med jodacetamid (sluttkonsentrasjon 10 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 ved inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Avhengig protease av interesse, protein / peptid-løsninger må renses-opp for å fjerne rester av buffer og alkylering agent. Bruk PepClean C-18 spin kolonner (Thermo) for peptid opprydding og Vivaspin Sentrifugal Konsentratorer (Sartorius) til å utveksle buffere for protein prøver.
- Gjenoppløse / utveksle peptider / proteiner i 20 ul protease reaksjonsbuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsin: 25 mM NH 4 3 HCO, pH 8,0) inneholdende 1:1 (v / v) endelige H 2 18 O (95%, Sigma ISOTEC).
- Trekke tilbake en nulltidspunktet prøven før tilsetningen av proteasen: Bland 0,5 ul av reaksjonsblandingen og 0,5 ul alfa cyano-4-hydroxycinnamicsyre matrise (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Spot prøven på en Opti-TOF 384 MALDI sikteplate (AB SCIEX) og la løsemiddel dråper ved romtemperatur til den er tørr (ca 5 min).
- Split reaksjonsoppløsningen i to aliquoter. Den første alikvot blir inkubert med proteasen av interesse (ECE-1: 75 nm; trypsin: 0,04 nM) ved romtemperatur eller den anbefalte temperatur for det spesielle enzym. Den andre alikvot blir inkubert uten protease og vil tjene som kontrollprøve. Den første delmengde representerer en standard prøve for protease-katalysert 18 O-merking og kan brukes til peptid og protein identifikasjon, deteksjon av proteolytiske aktiviteter og overvåking av proteolytisk spaltning reaksjoner. Den andre delmengde er brukt til å vise at 18 O-innlemmelse indusert av protease, og derfor er verken merking eller spalting forventet for denne prøven.
- Følg reaksjonen ved å fjerne reaksjons-alikvoter og fange dem som described Under Trinn 5 på tidsintervaller som synes passer. Reaksjonsbetingelsene som er beskrevet ovenfor blir brukt til å overvåke et proteolytisk reaksjon i opptil fire dager (ca. 24 flekker). Starte prøvetaking hver 5 min til 30 min, deretter oppdage hvert 30 min til 2 timer, deretter hver time inntil 8 timer og hver 8 timers inntil 4 dager. Spaltningsproduktene skal vises i løpet av de første 12 timer og underlaget skal være helt hydrolyseres etter 24 timer. Utvidet reaksjonstid inkubasjonstider tillate å definere stabile reaksjonsprodukter som er diskret fra reaksjon mellomprodukter, som er videre behandlet. Avhengig problemstilling og gitt enzym-substrat par, har fange ganger og inkubasjonstemperatur å være modulert å sikre optimal reaksjon prøvetaking.
- Etter den siste reaksjonen tidspunkt er flekket eller i mellom lengre spotting intervaller, er MALDI sikteplate sendt til Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS-analyse som beskrevet nedenfor (avsnitt B).
II. Paleo-tidsforløpet: Postdigestion merking av proteolytiske termini
- (Valgfritt) disulfidbindinger av proteiner (10 uM) og peptider (250 uM) er redusert med DTT (sluttkonsentrasjon 2,5 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 (begge tilberedes) ved inkubering i 30 minutter ved 50 ° C.
- (Valgfritt) Free cysteinene er alkylert med jodacetamid (sluttkonsentrasjon 10 mM) i 25 mM NH 4 HCO 3 ved inkubering i 30 minutter ved romtemperatur i mørket.
- Avhengig proteasen av interesse, protein / peptid-løsninger må renses-opp for å fjerne rester av buffer og alkylering agent. Bruk PepClean C-18 spin kolonner for peptid opprydding og Vivaspin Sentrifugal Konsentratorer for protein buffer utveksling.
- Gjenoppløse / bytte kan renses opp peptid produkter / proteiner i 20 ul protease reaksjonsbuffer (f.eks trypsin: 25 mm NH 4 3 HCO, pH 8,0) og fordøye med protease av interesse for ferdigstillelse (f.eks trypsin: 0,04 nM, 37 ° C, 12 timer).
- Opprydding spaltningsproduktene med PepClean C-18 spin kolonner. Dette trinnet vil eliminere gjenværende protease aktiviteter.
- Gjenoppløse / utveksle renses opp peptid produktene i 20 ul protease reaksjonsbuffer (trypsin: 25 mM NH 4 3 HCO, pH 8,0) inneholdende 1:1 (v / v) endelige H 2 18 O.
- Trekke tilbake en nulltidspunktet prøven før tilsetningen av enzymet: Bland 0,5 ul av reaksjonsblandingen og 0,5 ul alfa cyano-4-hydroxycinnamic syre matrise (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA). Spot prøve på en MALDI sikteplate og la løsemiddel dråper ved romtemperatur til den er tørr (ca 5 min).
- Split reaksjonsoppløsningen i to aliquoter. Den første alikvot blir inkubert med protease av interesse (f.eks trypsin: 0,04 nM) ved romtemperatur eller den anbefalte temperatur for det spesielle enzym. Den andre alikvot blir inkubert uten protease og vil tjene som en kontroll. Førstedelmengde representerer en standard prøve for protease-katalysert 18 O-postdigestion merking og kan brukes for peptid og protein kvantifisering. Den andre delmengde er brukt til å vise at 18 O-inkorporering er katalysert av proteasen, og derfor er ingen merking forventet for denne prøven.
- Følg reaksjonen ved å fjerne reaksjons-alikvoter og fange dem som beskrevet under trinn 7.) Ved tidsintervaller som synes passform. For eksempel, fant vi innledningsvis hver 5 min for opp til 30 min og hver 15 min etter at å overvåke carboxyl oksygen utveksling reaksjon katalysert av trypsin.
- Etter den siste reaksjonen tidspunkt er flekket eller i mellom lengre fange mellomrom MALDI sikteplate er sendt til Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS-analyse som beskrevet nedenfor (avsnitt B).
III. Aleo-tidsforløpet: syrekatalysert merking av karboksylgrupper
- Inkuber individuelle peptider (50 nM) med 1:1 (v / v) 18 O-beriket vann i than tilstedeværelse eller fravær (kontroll) av 0,1% (v / v) endelig trifluoreddiksyre (totalt volum 30 ul).
- Sample reaksjonsproduktene daglig 48 dager etter co-spotting en 0,5 pl alikvot av blandingen med 0.5μl alfa cyano-4-hydroxycinnamic syre matrise (10 mg / ml i 50% acetonitril, 0,1% TFA) direkte på en MALDI target plate.
- Mellom spotting intervaller og etter spotting av endelig reaksjon tidspunkt sender MALDI målplate for Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS-analyse, som beskrevet nedenfor i avsnitt B.
B. Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS datainnsamling og analyse
- Massespektra er ervervet på en 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Før analysen, er instrumentet kalibreres med en blanding av peptid standarder (Mass Standards Kit for Kalibrering av AB SCIEX TOF / TOF instrumenter) med en maksimal masse målefeil toleranse på ± 50 ppm og et minimum antall av seks topper å matche.
- MS spektra (masse utvalg400 - 4000 m / z) er ervervet i triplikat bruke positiv ion-modus med en justerbar laser intensiteten (3400 - 3800; trinnstørrelse 50) med en akseptabel base toppintensitet rekke 2000 - 45.000. Enkelt skudd er kjøpt for sub-spektra, med 400 totalt skudd / spektrum, stopp forhold trådt i kraft etter 800 sub-spektra er ervervet (bestått eller ikke bestått) eller 400 sub-spektra pass akseptkriterier. Ved lav-rikelig prøver eller i nærvær av komplekse biologiske bakgrunner den nedre ende av MS deteksjonsområdet bør heves til 800 m / z. I tillegg kan det være nødvendig for å fjerne salt og andre interfererende forbindelser med en prøve opprydding trinn som beskrevet tidligere eller ved LC separasjon.
- MS datafiler (. T2D filer) blir eksportert fra 4000-serien Explorer datainnsamling programvare og importert til våre interne laboratorium informasjonssystem, som utnytter MASCOT Distiller programvare (Matrix Science) for spektral prosessering og toppdeteksjon. Isotop konvolutterer deconvoluted og 18 O-innlemmelse Nøkkeltall bestemmes automatisk ved hjelp av en algoritme som ligner den som ble beskrevet av Mason et al. 12 og tilpasset av vår gruppe 9. Alternativt programvareverktøy som ZoomQuant 13 og Viper 14, så vel som kommersielle programvarepakker som BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) og Mascot Distiller Kvantitering Toolbox (Matrix Science) kan deconvolute 18 O-type data 15,16. 18 O-innlemmelse forholdstall er uttrykt som den relative bidrag til individuelle peptid isotop arter (dvs. peptider som inneholder 16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) til hele isotopiske konvolutten.
- For hver tidsforløpet eksperiment, de molekylære masser ([M + H] +) for alle gjenkjente peptid arter er hentet fra de tilknyttede MS datafiler og verdiene binned på en 100 ppm masse bredde.
- At minst tre [M + H] + er satt til å være nødvendig for å fylle en hylle. I tilfelle av kjente substrater, blir den filtrerte bin listen i forhold til en liste av proteolytiske spaltningsproduktene forutsies fra underlaget peptidsekvens med ExPASy FindPept verktøyet 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) og en 200 ppm masse feil aksept toleranse.
- MS / MS spektra er kjøpt for all masse verdier av spaltningsproduktene spådd av FindPept verktøyet og for bin verdier som har 18 O-incorporations forbundet med dem. MS / MS Innsamlingen på 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer i 1kV reflektor positiv ion modus, med en fast laser intensitet på 4200 og CID-gass i av-modus. 50 skudd er ervervet i en randomisert mønster per sub-spektra opp til totalt 40 sub-spektra per spot (som gir totalt 2000 bilder / spot).
- MS / MS datafiler (. T2D filer) blir eksportert fra 4000-serien Explorer datainnsamling programvare og importert til våre interne laboratorium informasjonssystem, er topper oppdages og MS / MS peak lister er assosiert med tilsvarende binned MS data.
- For peptid identifikasjon, er MS / MS peak lister søkte mot SwissProt databasen ved hjelp av MASCOT søkemotor med følgende søkeparametere: ingen enzym spesifisitet, 150 ppm forløper ion og 0,2 Da fragment ion masse toleranser.
- Peptid identifikasjoner kan i tillegg godkjent for bruk av data Explorer programvaren (AB SCIEX) ved å bekrefte de karakteristiske 18 O-innlemmelse mønstre på tvers av y-serien fragment ioner som beskrevet av Shevchenko et al. 18.
C. Forberedelse av Spectral Tid og 18 O-innlemmelse Tomter
Spectral tid plott: MS datafiler (. T2D filer) for hver reaksjon tidspunkt blir eksportert fra Data Explorer programvare som ASCII-filer ved hjelp av enmakro og importeres til en dataanalyse og grafisk program (f.eks Origin av OriginLab) og vises som fossen plott (figur 3).
18 O-innlemmelse plott: For hver binned peptid spaltningsprodukt, blir de relative bidrag fra individuelle peptid isotopen arter (16 O, 18 O 1 eller 18 O 2) ekstrahert over alle reaksjons tidspunkter og plottet mot tid (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte paleo-tidsforløpet arbeidsflyt for dynamisk overvåke inkorporering av 18 O-stabile isotoper til peptid spaltningsproduktene generert av proteolytiske enzymer. Den presenterte tilnærming er et allsidig verktøy til forholdsvis studere proteolytiske bearbeiding trasé for ulike underlag og proteasehemmere kombinasjoner. Ved prøvetaking proteolytiske reaksjoner flere ganger over i løpet av reaksjonen, gir paleo-tidsforløpet eksperiment Time-løst øyeblikksbilder av substrat og produkt abundances og bearbeiding detaljer. Co-spotting prøver med sure matriks løsning på en målplate stopper den enzymatiske reaksjonen og matrise krystallisering ytterligere bevarer prøven sammensetning. Derfor kan tidspunkter ettertid bli analysert av Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri MS / MS etter avslutningen av den enzymatiske reaksjonen. For å imøtekomme den data-rik natur av disse eksperimentelle arbeidsflyt, gjennomførte vi en semi-automatisk bioinformatikk system som beregner 18 O-formaion forholdstall for hver peptid. Fig. 3 viser et representativt spektral tidsforløpet plott av behandlingen av peptidet Endokinin C ECE-1. Paleo-tidsforløpet data er flerdimensjonal: Den utvidet bilde av MS data over hele massen utvalget samtidig viser abundances av peptid substrat samt abundances av peptidet produktene. Den tidsmessige ordning gir tyde sekvensen av cleavage hendelser og bestemme hvilke peptidfragmenter er stabile spaltningsproduktene. Den zoomet inn visning av MS data avslører isotopen konvolutter av hvert peptid og spalting-indusert 18 O-merking er lett identifisert ved sin karakteristiske isotopen distribusjon. 18 O-merking muliggjør positiv utvelgelse av spaltningsproduktene for senere identifikasjon av MS / MS. Til sammen fanger Paleo-tidsforløpet analysen dynamikken i proteolytisk prosessering og lar vurdere foretrukne kutteseter av proteaser. Enda et nivå av informasjonsjon kan oppnås avhengig enzymatisk mekanismen av den benyttede protease. Visse proteaser som serinprotease trypsin er i stand kovalent rebinding sine peptid spaltningsproduktene. . Hydrolyse av de acyl-enzym mellomresultater i inkorporering av et andre 18 O-atom i C-terminale karboksylgruppe Figur 4 viser de resulterende endringer i den relative bidraget av de forskjellige isotopomers over tid: Den innledende peptidbinding cleavage reaksjon resulterer i en 1:1 delt mellom 16 O og 18 O 1 peptid fraksjoner. Carboxyl oksygen utveksling reaksjon resulterer i økning av den 18 O 2 fraksjonen til 25% forhold ved likevekt med en samtidig reduksjon av den 16 O fraksjonen. Proteaser stand katalyserende karboksyl oksygen utveksling reaksjon kan derfor benyttes til ytterligere 18 O-merking arbeidsflyt, den postdigestion merking av proteolytisk termini. I disse typer eksperimenter, er substrater utgangspunktet fordøyd i fravær av H 2 18 O, peptid produktene renset og inkubert med et friskt batch av protease, men denne gangen i nærvær av 50% H 2 18 O. Figur 4 viser forskjeller i isotop inkorporering som kan observeres i disse to eksperimentelle arbeidsflyt og forskjellene i innlemmelse hastighet mellom individuelle peptid underlag. I postdigestion merking arbeidsflyt, satsen for begge 18 O-incorporations bestemmes av karboksyl oksygen utveksling reaksjon. Reaksjonshastigheten avhenger av hvor lett proteasen reagerer med sine spaltningsproduktene. Affiniteten for reaksjonen produktet kan indirekte bli brukt til å utlede den affiniteten proteasen til den opprinnelige peptid substrat. Slik informasjon kan være nyttig å finne ut hvilke peptidsekvenser er ideelle underlag for eksempel for tryptisk fordøyer i kvantitative proteomikk studier. Peptides som er lett spaltes og dobbel-merket av trypsin er sannsynlig å være proteotypic peptider som er reproduserbart og kvantitativt dannet og derfor ideell for komparative proteomikk studier.
Ved lav pH, oxygens av karboksylsyregrupper utveksling med det vandige oppløsningsmiddelet 19-20. Denne reaksjonen kan brukes som en alternativ tilnærming til protease-katalysert merking strategier for å innføre stabile isotoper inn peptider. I Aleo-tidsforløpet (syrekatalysert merking ansette 18 O-beriket vann) arbeidsflyt, overvåket vi den langsomme innarbeidelse av 18 O-atomer i syntetiske peptider. Den syre-katalyserte oksygen utveksling stoppet etter co-krystallisering med grunnmassen løsning på MALDI sikteplate, effektivt "fryser" isotopen fordelingen staten. Vi brukte Angiotensin 1 som modell peptid og undersøkt sin isotop konvolutt over tid (figur 5). Et opptak av to 18 O-atomer for hver bilboxyl gruppen ble observert. Under gjeldende eksperimentelle forhold, var syrekatalysert karboksyl oksygen utveksling reaksjon mye tregere enn proteasen-katalysert utveksling 9 og nådd likevekt bare etter 48 dager. Imidlertid tilbyr Aleo tilnærming fordelen av merking peptider som ikke gjenkjennes av proteaser. I tillegg, peptider innlemme flere 18 O-atomer avhengig antall sure sidekjeder, som kan resultere i fullstendig atskillelse av isotopen konvoluttene av umerket og merket arter. Den totale massen skiftet gir informasjon om antall sure rester i en gitt peptid og deres plassering kan utledes av analysen av MS / MS fragment ion masse skift. 18 O-merket peptider vise nær identisk kromatografisk atferd som sine umerkede kolleger, som gjør sine komparative analyser på samme elueringstid. Oppsummert syrekatalysert 18 O-merking kan tjene som et alternativ til kjemisk, nozymatic og metabolske merking nærmer vanligvis brukes i kvantitative proteomikk. En spesiell lovende anvendelsen av denne teknikken er bruken av 18 O-merket peptider som stabile isotopen standarder.
Figur 1. 18 O-baserte merking tilbyr en rekke tidsforløp arbeidsflyt. (I) Den protease-katalysert paleo-tidsforløpet arbeidsflyt tillater overvåking av dynamikken i proteolytisk spaltning reaksjoner. Avhengig protease, disse reaksjoner resulterer i (a) enkelt (for eksempel i tilfelle av visse metalloproteaser) eller (b) 18 O-dobbel inkorporering (f.eks i tilfelle av visse serinproteaser). (II) Dobbel 18 O-Labeler slike som trypsin kan også brukes i postdigestion merking arbeidsflyter, hvori 18 O-innlemmelse utelukkende mediert av proteasen-katalysertecarboxyl oksygen utveksling reaksjon. (III) I motsetning, stoler Aleo-tidsforløpet arbeidsflyt på syrekatalyserte karboksyl oksygen utveksling reaksjoner surt peptid side og terminal grupper. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Eksperimentelle arbeidsflyter av Paleo-og Aleo-tidsforløpet strategier. A) (I) I en protease-katalysert paleo-tidsforløpet eksperimentet substrater inkubert med en protease i nærvær av H 2 18 O resulterer i inkorporering av opptil to 18 O-atomer avhengig proteasen. (II) I en paleo postdigestion merking eksperimentet spaltningsproduktene fra en tidligere fordøyelse re-inkubert med en protease av interesse i nærvær av H 2 18 O. Proteaser stand dobbel merking (i arbeidsflyt I) vil katalysere inkorporering av to 18 O-atomer. (III) I en syrekatalysert Aleo eksperimentet, alle sure funksjonelle grupper innlemme 18 O-atomer B) tidsforløpet Analyse:.. Hos tidsinnstilte mellomrom blir aliquoter av reaksjonsblandingene samtidig flekket med matrise på MALDI-målplater Upon MS- datainnsamling, er spektrale tid plott av peptid cleavage reaksjoner samt 18 O-innlemmelse plott av individuelle peptid arter generert og spaltningsproduktene er valgt for MS / MS-baserte sekvens identifikasjon. Klikk her for å se større figur .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Figur 3. Spektrale tid plott viser dynamikken til proteolytisk spaltning reaksjoner. Ved å plotte MS spektra av paleo-tidsforløpet eksperimenter i en foss arrangement, er det mulig å samtidig overvåke nedbrytningen av substratet og fremveksten av mellomliggende og endelige spaltningsproduktene. Her, spaltning av den bioaktive peptidet Endokinin C ved Endotelin-converting enzyme-1 (ECE-1) er vist. Spaltningsproduktene ble identifisert ved MS / MS og deres isotopen konvolutter vises de karakteristiske 18 O-innlemmelse signaturer (uthevet i rødt).
Figur 4. Serinproteaser som trypsin megle inkorporering av opptil to 18 O-atomer inn peptid spaltningsproduktene. (I) Trong> I protease-baserte merking arbeidsflyt, de peptidbinding cleavage reaksjon resulterer i en 50% enkelt 18 O-innlemmelse ratio for ferskt genererte peptid spaltningsproduktene (svarte prikker indikerer umerkede, røde single-merkede peptid fraksjoner). Proteaser som REBIND deres reaksjonsprodukter (f.eks serinproteaser som trypsin) ytterligere katalysere inkorporering av en andre 18 O atom via karboksyl oksygen utveksling reaksjon (grønne prikker, dobbel-merkede peptid fraksjon). Ved likevekt, en etikett distribusjon av 0.25:0.5:0.25. Er (u-;; single-dobbel-merket) nådd (II) I postdigestion merking av proteolytisk termini arbeidsflyt, ingen peptidbinding cleavages oppstår. Isteden, er inkorporering av opptil to 18 O-atomer utelukkende basert på karboksyl oksygen utveksling reaksjon. Derfor oppstår 18 O-innlemmelse bare med proteaser som REBIND sine peptid spaltningsproduktene.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 5. Syrekatalysert 18 O-merking fører til inkorporering av to 18 O-atomer per karboksylgruppen. Løpet av eksperimentet, den isotopiske konvolutten av Angiotensin-1 gjennomgikk flere 2 Da masse skift (stiplede linjer) tilsvarende opptaket 18 O-atomer. Nettstedene til 18 O-innlemmelse er markert i aminosyresekvens (blå).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å kombinere stabil isotop merking og høy oppløsning massespektrometri i en tid-løst måte, lar paleo-tidsforløpet metoden for en dynamisk analyse av generasjon peptid produktene. Analysen kan benyttes for å generere stabile isotopically merket peptider for kvantitative og kvalitative proteomikk studier og å evaluere kinetikken hvorved proteotypic peptider blir generert. Videre er paleo-tidsforløpet utformet for å evaluere proteolytiske trasé under spesifikke, fysiologisk relevante betingelser ex vivo. Endogene proteiner, peptider og proteaser samt syntetiske peptider og rekombinante proteaser kan utnyttes i arbeidsflyten. Avhengig av det spesielle proteolytiske reaksjonen skal undersøkes, analysebetingelser og fange ganger kan tilpasses for å gi for optimal prøvetaking av reaksjonsprosessen. I vår erfaring, er det nyttig å bremse proteolytiske reaksjoner ned (for eksempel ved å bruke lave enzym konsentrasjoner, romtemperatur) for å tillate praktiske manuelle samplingsintervaller Som med andre stabile-isotop merking metoder, avvik for de eksperimentelle 18 O-inkorporering ratio målinger er små -. vanligvis mindre enn 5% for topper med tilstrekkelig ion statistikk. Den generelle protokoll kan enkelt tilpasses til andre analysebetingelser formater, for eksempel skjerming av et stort sett av syntetiske substrater eller karakterisering av proteolytisk prosessering av endogene peptider fra komplekse biologiske prøver (f.eks, cellekulturmedier, kroppsvæsker). Vi har tidligere vist hvordan Paleo-tilnærming kan deles med en LC-separasjon trinn, og brukes til å definere dynamisk komposisjon av den menneskelige salivary peptidome 9. Proteolytiske signaturer identifisert av Paleo-tidsforløpet gir viktige fakta om substratspesifisitet av protease av interesse. I tillegg, gir de tid-løst data også kinetisk informasjon. Slik kunnskap er spesielt nyttig ved evalueringen av proteotypic peptider for kvantitative proteomics studier, hvor valg av reproduserbare og svært rikelig target peptider er essensielt 21. Likeledes, identifisere hastighetsbegrensende trinn i proteolytiske trasé er av stor interesse for utvikling av nye protease-baserte legemidler. Proteaser er sentrale faktorer i mange fysiologiske og patologiske prosesser (f.eks kardiovaskulære lidelser, nevrodegenerative sykdommer, kreft) og slike observasjoner kan åpne opp nye muligheter for terapeutiske intervensjoner. Den Aleo-strategi - syrekatalysert merking av karboksylgrupper - er lett å påføre til syntetiske og endogene peptider å produsere stabile isotopically kodet standarder. Kinetikken i syre-katalysert reaksjon er mye langsommere enn enzym-katalysert reaksjon. Derfor eksperimenter må nøye planlagt fremover. Aleo-tidsforløpet er en lav-kost alternativ til kjemiske, metabolske og syntetisk merking methods dag brukes i proteomikk studier. Merkingen kan overvåkes for å kontrollere at 18 O-inkorporering nådd likevekt, som kan være en fordel i forhold til andre stabile isotop merking metoder. I konklusjonen, Leo-tidsforløpet arbeidsflyt beskrevet her er allsidige verktøy som kan kreativt være ansatt i mange kvalitative og kvantitative proteomikk studier samt protease forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
