Summary
وضع العلامات النظائر المستقرة العمل توظيف
Abstract
النظائر المستقرة هي أدوات أساسية في مطياف الكتلة البيولوجية. تاريخيا، تم 18 O-النظائر المستقرة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة آليات الحفاز من الإنزيمات المحللة للبروتين 1-3. مع ظهور البروتيوميات الطيف القائم الشامل، أصبح إدماج إنزيمي المحفزة من 18 ذرات من O-مستقر الماء المخصب isotopically وسيلة شعبية لمقارنة مستويات بروتين تعبير كميا (مراجعتها من قبل Fenselau وياو 4، مياجي وراو 5 و يي وآخرون 6). 18 O وضع العلامات تشكل بديلا بسيطة ومنخفضة التكلفة للمواد الكيميائية (مثل iTRAQ، ICAT) والتمثيل الغذائي تقنيات الوسم (على سبيل المثال SILAC) 7. اعتمادا على الأنزيم البروتيني المستخدمة، يمكن وضع العلامات 18 O يؤدي إلى إدماج تصل إلى ذرات منهما 18-O في المجموعة C-الكربوكسيل محطة للمنتج الانقسام 3 8. لدينا في باليو (ع rotease-A abeling ل ه ssisted mploying 18 O التخصيب الماء) تكييف الأنزيمية 18 O وضع العلامات، ونحن تستخدم 50٪ 18 O-المخصب لانتاج المياه التوقيعات النظائر مميزة. بالاشتراك مع عالية الدقة بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز التأين وقت من رحلة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب (MALDI-TOF/TOF MS / MS)، يمكن استخدام المغلفات النظائر لتحديد المنتجات المميزة الانقسام مع مستوى عال من الدقة. ونحن قد استخدمت سابقا باليو-منهجية لكشف وتميز البروتياز الذاتية 9 و رصد ردود بروتين 10-11. منذ باليو بترميز جوهر رد الفعل الانقسام بروتين، والإعداد التجريبية هو enri بسيطة والكيمياء الحيويةيمكن الخطوات chment من المنتجات الانقسام التحايل. يمكن بسهولة باليو-الأسلوب أن تمتد إلى (ط) التجارب بالطبع الوقت الذي رصد لديناميات تفاعلات الانقسام وبروتين (ب) تحليل العينات البيولوجية في التحلل البروتيني المعقد الذي يمثل الظروف الفسيولوجية. باليو-TimeCourse تجارب مساعدة في تحديد خطوات المعالجة معدل منظم للتفاعل وسيطة في مجمع ردود الفعل مسار بروتين. وعلاوة على ذلك، فإن رد فعل باليو تتيح لنا التعرف الإنزيمات المحللة للبروتين مثل التربسين سيرين البروتياز قادر إلى rebind المنتجات الانقسام وتحفيز إدماج في 18 2 O-ذرية. ويمكن استخدام مثل هذه "انقر نقرا مزدوجا وضع العلامات" الانزيمات لpostdigestion 18 O وضع العلامات، والتي وصفت حصرا الببتيدات عن طريق تفاعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل. استراتيجية الثالث من عمرنا يمتد وصفها توظيف 18 O التخصيب خارج المياه الانزيمات ويستخدم الرقم الهيدروجيني الحمضية الظروف لإدخال 18 علامة النظائر مستقرة O-atures في الببتيدات.
Protocol
وقدم ليو-سير العمل تسمح لوضع العلامات النظائر المستقرة للهضم البروتين والببتيدات الاصطناعية. بالطبع هذه التجارب الزمن (الشكل 1) تنطبق على الدراسات المقارنة البروتيوميات والكمية وكذلك البحوث البروتيني. لكل سير عمل يتكون من خطوتين التجريبية (الشكل 2): A) الساعة أخذ العينات من كل حل 18 رد فعل النظائر ترميز O-مستقرة (البروتيني المحفزة الانقسام الببتيد؛ البروتيني المحفزة تبادل الأكسجين الكربوكسيل التفاعل؛ حمض الكربوكسيل حفز تبادل الأكسجين رد فعل) وتحليل الإفطار) من خلال مطياف الكتلة وتمثيل رسومي للحركية O-التأسيس 18.
تجارب A. TimeCourse
I.-باليو TimeCourse: البروتياز المحفزة وسم الانشقاقات بروتين
- (اختياري) يتم تخفيض السندات ثاني كبريتيد البروتينات (10 ميكرومتر) والببتيدات (250 ميكرومتر) مع DTT (تركيز النهائي 2.5 ملم)25 مم في NH 4 HCO 3 (كلا الطازجة) من قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 50 ° C.
- (اختياري) والألكيلية cysteines الحرة مع iodoacetamide (تركيز النهائي 10 ملم) 25 مم في NH 4 HCO 3 في الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- اعتمادا على الأنزيم البروتيني من الفائدة، والبروتين / الببتيد الحلول تحتاج إلى تنظيفها لإزالة متابعة العازلة المتبقية وكيل ألكلة. استخدام الأعمدة PepClean C-18 زيادة ونقصان (الحرارية) لتنظيف الببتيد والمكثفات Vivaspin الطرد المركزي (سارتوريوس) لتبادل مخازن للعينات البروتين.
- Redissolve / الببتيدات تبادل / البروتينات في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (ECE-1: 50 مم MES-KOH، ودرجة الحموضة 5.5؛ التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 1:1 (V / V) H 2 النهائي 18 O (95٪، سيغما Isotec).
- سحب نقطة الصفر مرة العينة قبل إضافة الأنزيم البروتيني: مزيج 0،5 ميكرولتر من خليط التفاعل و 0.5 ميكرولتر ألفا cyano-4-hydroxycinnamicحمض مصفوفة (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA). بقعة على عينة OPTI-TOF MALDI 384 لوحة الهدف (AB SCIEX) وترك قطرات المذيب في درجة حرارة الغرفة حتى تجف (حوالي 5 دقائق).
- تقسيم محلول التفاعل إلى قسمين مأخوذة. سيتم المحتضنة في قسامة الأولى مع الأنزيم البروتيني من الفائدة (ECE-1: 75 نانومتر؛ التربسين: 0.04 نيوتن متر) عند درجة حرارة الغرفة أو درجة الحرارة الموصى بها لانزيم معين. سيتم المحتضنة في قسامة ثانية دون البروتيني، وسيكون بمثابة نموذج السيطرة. وقسامة الأول يمثل عينة القياسية لالبروتيني المحفزة 18 O وضع العلامات، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيد والبروتينات، والكشف عن الأنشطة بروتين ورصد ردود الفعل الانقسام بروتين. يتم استخدام قسامة ثانية لإظهار أن يسببها 18 O-التأسيس من قبل الأنزيم البروتيني، وبالتالي، لا يتوقع وضع العلامات ولا الانقسام لهذه العينة.
- متابعة رد فعل رد فعل مأخوذة عن طريق إزالة واكتشاف لهم كما قصرالخطوة 5 تحت صفه ب على فترات زمنية يبدو كما مناسبا. يتم استخدام ظروف التفاعل المذكورة أعلاه لمراقبة رد فعل بروتين لمدة تصل إلى أربعة أيام (تقريبا 24 بقع). بدء أخذ العينات كل 5 دقائق حتى 30 دقيقة، ثم كل بقعة 30 دقيقة حتى 2 ساعة، ثم كل ساعة حتى 8 ساعة وكل ساعة 8 حتى 4 أيام. يجب أن تظهر منتجات انشقاق داخل ساعة 12 الأولى والركيزة يجب أن يكون تحلل تماما بعد 24 ساعة. تمديد أوقات رد الفعل حضانة تسمح لتحديد المنتجات التي هي رد فعل مستقرة منفصلة من رد فعل وسيطة، والتي يتم تجهيزها أخرى. اعتمادا على سؤال البحث، ونظرا أزواج انزيم الركيزة، واكتشاف مرات حرارة الحضانة والتضمين لتكون الأمثل لضمان أخذ العينات التفاعل.
- بعد وقت رد الفعل رصدت النهائي أو نقطة في فترات ممتدة بين اكتشاف، يقدم لوحة الهدف MALDI لتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه (B القسم).
II. باليو-TimeCourse: Postdigوضع العلامات estion من مصطلحات بروتين
- (اختياري) يتم تخفيض السندات ثاني كبريتيد البروتينات (10 ميكرومتر) والببتيدات (250 ميكرومتر) مع DTT (تركيز النهائي 2.5 ملم) في 25 ملم NH 4 HCO 3 (كلا الطازجة) من قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 50 ° C.
- (اختياري) والألكيلية cysteines الحرة مع iodoacetamide (تركيز النهائي 10 ملم) 25 مم في NH 4 HCO 3 في الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- اعتمادا على الأنزيم البروتيني من الفائدة، والبروتين / الببتيد الحلول تحتاج إلى تنظيفها لإزالة متابعة العازلة المتبقية وكيل ألكلة. استخدام الأعمدة PepClean C-18 لتنظيف تدور الببتيد والمكثفات Vivaspin الطرد المركزي لتبادل العازلة البروتين.
- Redissolve / تبادل المنتجات تنظيفها الببتيد / البروتينات في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (مثل التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) وخلاصة مع البروتيني التي تهم إنجاز (مثل التربسين: 0.04 نانومتر، 37 ° C و 12 ساعة).
- منتجات تنظيف الانقسام مع الأعمدة PepClean C-18 زيادة ونقصان. وهذه الخطوة القضاء على الأنزيم البروتيني الأنشطة المتبقية.
- Redissolve / تبادل المنتجات تنظيفها الببتيد في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 1:1 (V / V) H النهائي 2 18 O.
- سحب نقطة الصفر مرة العينة قبل إضافة انزيم: مزيج 0،5 ميكرولتر من خليط التفاعل و 0.5 ميكرولتر حمض ألفا مصفوفة cyano-4-hydroxycinnamic (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA). بقعة العينة على لوحة الهدف MALDI وترك قطرات المذيب في درجة حرارة الغرفة حتى تجف (حوالي 5 دقائق).
- تقسيم محلول التفاعل إلى قسمين مأخوذة. سيتم المحتضنة في قسامة الأولى مع الأنزيم البروتيني من الفائدة (على سبيل المثال التربسين: 0.04 نيوتن متر) عند درجة حرارة الغرفة أو درجة الحرارة الموصى بها للانزيم معين. سيتم المحتضنة في قسامة ثانية دون البروتيني، وسيكون بمثابة عنصر تحكم. أولقسامة تمثل عينة قياسية لوضع العلامات البروتيني المحفزة O-18 و postdigestion يمكن استخدامها لالببتيد وتقدير البروتين. يتم استخدام قسامة ثانية لإظهار أن يتم تحفيز 18 O-التأسيس من قبل الأنزيم البروتيني، وبالتالي، لا يتوقع وضع العلامات لهذه العينة.
- متابعة رد فعل رد فعل مأخوذة عن طريق إزالة واكتشاف لهم كما هو موضح في الخطوة 7.) في فترات زمنية يبدو كما مناسبا. على سبيل المثال، رصدت في البداية نحن كل 5 دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة كل 15 دقيقة وبعد ذلك تبادل لمراقبة الأكسجين الكربوكسيل رد فعل يحفزه التربسين.
- بعد وقت رد الفعل رصدت النهائي أو نقطة في فترات ممتدة بين اكتشاف يقدم لوحة الهدف MALDI لتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه (B القسم).
III. اليو-TimeCourse: حمض المحفزة وسم مجموعات الكربوكسيل
- احتضان الببتيد الفردية (50 نانومتر) مع 1:1 (V / V) 18 O-المخصب المياه في رانه جود أو غياب (التحكم) من 0.1٪ (V / V) حمض trifluoroacetic النهائي (المجموع 30 حجم ميكرولتر).
- العينة منتجات التفاعل اليومي لمدة 48 يوما من شارك في اكتشاف وقسامة 0،5 ميكرولتر من خليط من المصفوفة مع 0.5μl حمض ألفا cyano-4-hydroxycinnamic (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA) مباشرة على الهدف MALDI لوحة.
- بين فترات اكتشاف وبعد ان شاهد رد فعل من وجهة مرة الأخيرة تقدم MALDI وحة هدفا للتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه في الفرع باء.
B. MALDI-TOF/TOF الحصول على البيانات MS / MS وتحليل
- يتم الحصول على أطياف الشامل على محلل TOF 4800 / TOF MALDI (AB SCIEX).
- قبل التحليل، ومعايرة أجهزة القياس مع مزيج من المعايير الببتيد (قداس معايير كيت لمعايرة أدوات AB TOF / TOF SCIEX) التسامح مع كتلتها القصوى الخطأ قياس 50 ± جزء في المليون، وعدد لا تقل عن ستة قمم للمباراة.
- MS الأطياف (المدى الشامليتم الحصول على 4000 م / ض) في ثلاث نسخ باستخدام الوضع الإيجابي مع أيون قابلة للتعديل كثافة الليزر (3400 - - 400 3800؛ حجم الخطوة 50) مع مجموعة قاعدة مقبولة شدة ذروة 2،000 - 45،000. يتم الحصول على لقطات واحدة لأطياف الفرعية، مع 400 طلقات الكل / الطيف، والتوقف عن ظروف حيز التنفيذ منذ 800 الأطياف الفرعية يتم الحصول على (تمرير أو فشل) أو 400 تمريرة معايير القبول الفرعية الأطياف. وينبغي في حالة منخفضة وفيرة عينات أو في وجود خلفيات البيولوجية المعقدة يمكن رفع الطرف الأدنى من نطاق الكشف MS إلى 800 م / ض. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الضروري لإزالة الملح وغيرها من المركبات التدخل في عينة خطوة تنظيف كما هو موضح سابقا أو عن طريق فصل LC.
- ويتم تصدير ملفات البيانات MS (. t2d الملفات) من سلسلة 4000 مستكشف البرامج الحصول على البيانات واستيرادها إلى لدينا في المنزل المختبرات نظام المعلومات، والتي تستخدم البرمجيات MASCOT المقطر (مصفوفة العلوم) للتجهيز والكشف الطيفي الذروة. النظائر المغلفاتهي deconvoluted و 18 O-إدماج نسب تحدد تلقائيا باستخدام خوارزمية مماثلة لتلك التي وصفها ماسون وآخرون 12 و تكييفها من قبل مجموعتنا 9. بدلا من ذلك، أدوات البرمجيات مثل الافعى ZoomQuant 13 و 14، وكذلك حزم البرامج التجارية مثل كما إكسبرس BioWorks (الحرارية فيشر العلمية) والتميمة المقطر أدوات الكمي يمكن (مصفوفة العلوم) deconvolute 18 O من نوع البيانات 15،16. وعبر 18 O-إدماج نسب والإسهامات النسبية للفرد الأنواع النظير الببتيد (أي الببتيدات تحتوي على 16 O، 18 O 18 O 1 أو 2) لالمغلف النظائر بأكمله.
- لكل تجربة TimeCourse، الجماهير الجزيئية ([M + H] +) ليتم استخراج جميع أنواع الببتيد من الكشف عن الملفات المقترنة البيانات MS القيم واهمال في عرض جزء في المليون الشامل 100.
- Aر الأقل ثلاثة [M + H] + من المقرر أن تكون هناك حاجة لملء بن. في حالة ركائز معروفة، تتم مقارنة قائمة تمت تصفيتها بن لقائمة من المنتجات الانقسام بروتين توقع من الركيزة تسلسل الببتيد باستخدام أداة FindPept ExPASy 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) وعلى 200 جزء في المليون الخطأ الشامل التسامح القبول.
- يتم الحصول على MS / MS لجميع أطياف القيم الشامل من المنتجات الانقسام وتوقع من قبل أداة FindPept وللقيم التي لديها بن 18 O-المدرجه المرتبطة بها. يتم الحصول على MS / MS البيانات على محلل TOF 4800 / TOF MALDI في وضع عاكس 1KV أيون إيجابية، مع كثافة الليزر الثابتة من 4200 و CID الغاز في وضع إيقاف التشغيل. يتم الحصول على 50 رصاصة في نمط العشوائية في أطياف الفرعية تصل إلى ما مجموعه 40 الأطياف الفرعية في بقعة (مما يعني أن مجموع من 2،000 لقطات / البقعة).
- ويتم تصدير MS / MS ملفات البيانات (. t2d الملفات) من سلسلة 4000 ExploRER برامج الحصول على البيانات واستيرادها إلى لدينا في المنزل المختبرات نظام المعلومات، تم الكشف عن القمم وترتبط MS / MS قوائم الذروة مع البيانات MS اهمال المقابلة.
- لتحديد الببتيد، يتم البحث MS / MS قوائم الذروة مقابل قاعدة البيانات SwissProt باستخدام محرك البحث MASCOT مع المعلمات البحث التالية: لا خصوصية انزيم، 150 جزء في المليون أيون السلائف و 0.2 جزء أيون التحمل الشامل دا.
- بالإضافة إلى ذلك يمكن التعرف الببتيد يمكن التحقق من صحة البيانات باستخدام مستكشف البرامج (AB SCIEX) من خلال التأكيد على السمة 18 O-إدماج أنماط عبر أيونات جزء Y-سلسلة كما وصفها آخرون شيفتشينكو 18.
C. إعداد التوقيت الطيفي و 18 مؤامرات O-التأسيس
المؤامرات الوقت الطيفية: يتم تصدير ملفات البيانات MS (. t2d الملفات) لكل نقطة رد الفعل الوقت من برنامج مستكشف والبيانات ASCII-الملفات باستخدامالكلي واستيرادها إلى تحليل البيانات والرسوم البيانية برنامج حاسوبي (على سبيل المثال من أصل OriginLab) ويظهر على شكل شلال مؤامرات (الشكل 3).
18 O-إدماج المخططات: لكل منتج الببتيد الانقسام اهمال، يتم استخراج المساهمات النسبية للدول، فرادى الأنواع النظير الببتيد (16 O و 18 O 18 O 1 أو 2) في جميع نقاط وقت رد الفعل وتآمر مع الزمن (الشكل 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا سير العمل باليو-TimeCourse لرصد حيوي إدماج نظائر مستقرة O-18 في المنتجات الانقسام الببتيد التي تم إنشاؤها بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين. النهج قدم هو أداة مرنة لدراسة مسارات المعالجة نسبيا لبروتين الركيزة مختلفة وتركيبات البروتيني. ردود الفعل من قبل أخذ العينات المحللة للبروتين مرارا وتكرارا على مدى رد الفعل، والتجربة باليو-TimeCourse يقدم لقطات من وقت حل الركيزة وفرة المنتج ومعالجة المعلومات. شارك في اكتشاف عينات بمحلول حمضي مصفوفة على لوحة الهدف يتوقف رد الفعل الأنزيمية وبلورة مزيد من مصفوفة يحفظ تكوين العينة. ولذلك، يمكن أن بأثر رجعي نقاط زمنية تحليلها من قبل MS MALDI-TOF/TOF / MS بعد الانتهاء من رد الفعل الأنزيمية. لاستيعاب طبيعة البيانات الغنية من هذه العمل التجريبي، نفذنا نظام المعلوماتية الحيوية شبه التلقائية التي تحسب 18 O-incorporatنسب أيون لكل الببتيد الشكل. 3 يبين ممثل دوام الطيفية قطعة تجهيز الببتيد C Endokinin اللجنة الاقتصادية لأوروبا-1. باليو-TimeCourse البيانات متعددة الأبعاد: رأي الموسع لبيانات MS عبر مجموعة الشامل بأكمله في وقت واحد يبين وفرة الركيزة الببتيد وكذلك وفرة من المنتجات الببتيد. الترتيب الزمني يسمح فك رموز تسلسل الأحداث وتحديد الشق الذي شظايا الببتيد من المنتجات الانقسام مستقرة. والتكبير في ضوء البيانات MS يكشف عن المغلفات نظائر كل الببتيد والتي يسببها الانقسام يتم التعرف بسهولة 18 O وضع العلامات من قبل توزيعه النظائر مميزة. 18 O وضع العلامات يسمح لاختيار إيجابية من المنتجات الانقسام لتحديد اللاحقة التي MS / MS. تماما، الفحص باليو-TimeCourse يجسد ديناميكية تجهيز بروتين ويسمح تقييم المواقع المفضلة لانشقاق البروتياز. بعد مستوى آخر من انفورماويمكن الحصول على نشوئها اعتمادا على آلية الأنزيمية للالبروتيني المستخدمة. البروتياز معينة مثل التربسين سيرين البروتياز قادرة على rebinding تساهميا منتجاتها الانقسام الببتيد. . التحلل المائي للنتائج أسيل انزيم سيطة في التأسيس من الثانية 18 O-ذرة في المجموعة C-محطة الكربوكسيل ويبين الشكل 4 التحولات الناتجة في المساهمة النسبية للisotopomers مختلفة على مر الزمن: وببتيد السندات الأولية الانقسام رد فعل النتائج في الانقسام و1:1 بين 16 و 18 O O الكسور الببتيد 1. تبادل الأكسجين نتائج رد الفعل الكربوكسيل في زيادة نسبة 18 2 O إلى نسبة 25٪ في حالة توازن مع ما يصاحب ذلك من انخفاض في نسبة O 16. وبالتالي، يمكن البروتياز قادرة على تحفيز تبادل الأكسجين الكربوكسيل رد فعل يمكن استخدامها لسير عمل إضافية O-وضع العلامات 18، وصفها postdigestion من بروتين ثالثاصغيرة. في هذه الأنواع من التجارب، يتم هضمها في البداية ركائز في غياب H 2 18 O، منتجات تنظيف الببتيد وحضنت مع دفعة جديدة من الأنزيم البروتيني، ولكن هذه المرة في وجود 50٪ H 2 18 O. ويبين الشكل 4 الاختلافات في تأسيس النظائر التي يمكن ملاحظتها في هذه العمل التجريبيتين والاختلاف في سرعة دمج بين ركائز الببتيد الفردية. في postdigestion سير العمل وضع العلامات، يتم تحديد معدل لكلا 18 O-المدرجه عن طريق تفاعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل. معدل التفاعل يعتمد على كيفية بسهولة البروتيني يتفاعل مع منتجات الانقسام والخمسين. قد تقارب غير مباشرة للمنتج رد الفعل أن تستخدم للاستدلال على النسب من البروتياز إلى الركيزة الببتيد الأصلي. هذه المعلومات يمكن أن تكون مفيدة لتحديد تسلسل الببتيد هي ركائز المثالي على سبيل المثال لتريبسيني هضم في الدراسات الكمية البروتيوميات. Peptides التي المشقوق بسهولة ومزدوجة من جانب المسمى التربسين من المحتمل أن تكون الببتيدات proteotypic التي بتكاثر كمي وشكلت وبالتالي مثاليا للدراسات المقارنة البروتيوميات.
في انخفاض الرقم الهيدروجيني، الأكسجين من مجموعات حمض الكربوكسيلية مع تبادل 19-20 المذيب المائي. ويمكن استخدام هذا التفاعل كنهج بديل لالبروتيني المحفزة وصفها استراتيجيات لإدخال نظائر مستقرة في الببتيدات. في اليو-TimeCourse (حمض المحفزة وضع العلامات توظيف 18 O التخصيب الماء) سير العمل، رصدنا إدماج بطيئة من 18 إلى ذرات O-الببتيدات الاصطناعية. توقف تبادل الأكسجين حمض المحفزة بعد تبلور بالتعاون مع حل مصفوفة على لوحة الهدف MALDI، على نحو فعال "تجميد" الدولة توزيع النظائر. كنا أنجيوتنسين (1)، والببتيد نموذج فحص المغلف لها نظير على مر الزمن (الشكل 5). وامتصاص ذرات منهما 18-O لكل سيارةولوحظ مجموعة boxyl. في ظل الظروف التجريبية الحالية، وكان حمض الكربوكسيل حفز تبادل الأكسجين رد فعل أبطأ بكثير من تبادل البروتيني المحفزة 9 و التوصل إلى التوازن إلا بعد 48 يوما. ومع ذلك، فإن النهج اليو يوفر ميزة وضع العلامات الببتيدات التي لا تعترف بها البروتياز. وبالإضافة إلى ذلك، تتضمن عدة الببتيدات 18 O-ذرات اعتمادا على عدد من السلاسل الجانبية الحمضية، والتي يمكن أن تؤدي إلى الانفصال الكامل للمغلفات النظائر الأنواع غير المسماة وصفت. التحول الشامل عموما يوفر معلومات عن عدد من مخلفات حمضية في الببتيد معين ويمكن أن تستمد موقعها من خلال تحليل التحولات جزء MS / MS الشامل أيون. 18 O-صفت الببتيدات عرض بالقرب من السلوك الكروماتوغرافي متطابقة ونظرائهم الخالي من الملصقات، التي تمكن تحليل النسبية في وقت شطف متطابقة. وباختصار، يمكن للحمض المحفزة 18 O وضع العلامات بمثابة بديل لمادة كيميائية، ENوضع العلامات الأيضية zymatic والنهج المستخدمة عادة في البروتيوميات الكمية. طلب واحد واعدة خاصة من هذه التقنية هو استخدام من 18 الببتيدات O-وصفت بأنها المعايير النظائر المستقرة.
الشكل 1. 18 O القائم على وضع العلامات يقدم مجموعة متنوعة من مهام سير العمل دوام. (I) والبروتيني المحفزة باليو-TimeCourse سير العمل يسمح لرصد ديناميات تفاعلات الانقسام بروتين. اعتمادا على الأنزيم البروتيني، وهذه نتيجة ردود الفعل في (أ) واحد (على سبيل المثال في حالة metalloproteases معينة) أو (ب) 18 O مزدوجة التأسيس (على سبيل المثال في حالة البروتياز سيرين معينة). مثل 18 O-مزدوجة اضع (II) كما يمكن أن تستخدم أيضا التربسين في العمل وضع العلامات postdigestion، التي توسطت فقط 18 O-التأسيس من قبل حفز-البروتينيالكربوكسيل رد فعل تبادل الأوكسجين. (III) في المقابل، سير العمل اليو-TimeCourse تعتمد على حمض الكربوكسيل المحفزة ردود الفعل تبادل الأكسجين من الجانب الببتيد الحمضية وجماعات محطة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 2. العمل التجريبية للباليو واستراتيجيات اليو-TimeCourse. A) (I) في تجربة باليو-TimeCourse البروتيني المحفزة، وحضنت مع ركائز البروتيني في وجود H 2 18 O مما أدى إلى إدماج ما يصل الى اثنين 18 O-ذرات اعتمادا على الأنزيم البروتيني. (II) في وضع العلامات باليو التجربة postdigestion، ومنتجات من الانقسام الهضم السابقة مع إعادة حضنت والبروتيني من الاهتمام في وجود H 2 18 O. والبروتياز قادرة على وضع العلامات مزدوجة (في سير العمل I) تحفيز إدماج منهما 18 ذرات-O. (III) في تجربة اليو حمض المحفزة، جميع المجموعات الوظيفية الحمضية تتضمن 18 O-ذرات B) تحليل TimeCourse:. على فترات محددة زمنيا، ومأخوذة من مخاليط رد فعل شارك في مصفوفة مع رصدت على MALDI المستهدفة لوحات عند MS- الحصول على البيانات، يتم إنشاء المخططات الوقت الطيفي لردود الفعل الانقسام الببتيد وكذلك 18 O-التأسيس المؤامرات الأنواع الببتيد الفردية ويتم اختيار المنتجات لتحديد تسلسل الانقسام MS / MS مقرا لها. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
الشكل 3. المؤامرات الوقت الطيفية عرض ديناميكية من التفاعلات بروتين الانقسام. بالتآمر بواسطة MS-أطياف باليو TimeCourse التجارب في ترتيب الشلال، فمن الممكن لمراقبة تدهور في وقت واحد الركيزة وظهور الانقسام المنتجات الوسيطة والنهائية. هنا، والانقسام من C النشطة بيولوجيا Endokinin الببتيد بواسطة انزيم تحويل Endothelin--1 (ECE-1) ويرد. وتم تحديد المنتجات الانقسام بواسطة MS / MS والمغلفات الخاصة بهم نظير عرض 18 O-سمة إدراج التواقيع (المميزة باللون الأحمر).
الشكل 4. سيرين البروتياز مثل التربسين توسط في إدماج ما يصل الى اثنين 18 O-الذرات إلى منتجات الانقسام الببتيد. (I) ترونج> في سير العمل وضع العلامات البروتيني يستند إلى نتائج الانقسام السندات الببتيد في رد فعل 50٪ نسبة واحد O-18 لتأسيس إنشاؤها حديثا المنتجات الانقسام الببتيد (تشير النقط السوداء، الحمراء الخالي من الملصقات التي تحمل علامات الكسور واحدة الببتيد). البروتياز التي rebind منتجات رد فعلهم (البروتياز سيرين على سبيل المثال مثل التربسين) حفز مزيد من إدماج ذرة 2 O 18 عن طريق رد الفعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل (النقاط الخضراء، انقر نقرا مزدوجا المسمى جزء الببتيد). في حالة توازن، وتوزيع تسمية 0.25:0.5:0.25. يتم التوصل إلى (UN-؛؛ واحد نقرا مزدوجا المسمى) (II) في وضع العلامات postdigestion من سير العمل تيرميني بروتين، لا الانشقاقات تحدث ببتيد السندات. بدلا من ذلك، يقوم حصرا على إدماج تصل إلى ذرات منهما 18-O على رد فعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل. لذلك، 18 O-التأسيس تحدث فقط مع البروتياز التي rebind منتجاتها الانقسام الببتيد.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 5. حمض المحفزة 18 O وضع العلامات يؤدي إلى إدماج منهما 18-O ذرات لكل مجموعة الكربوكسيل. وعلى مدى التجربة، المغلف النظائر من أنجيوتنسين-1 خضع متعددة الشامل دا +2 التحولات (الخطوط المتقطعة) المقابلة لامتصاص من 18 O-الذرات. ويسلط الضوء على مواقع 18 O-إدراجها في تسلسل الأحماض الأمينية (الأزرق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من خلال الجمع بين النظائر المستقرة وضع العلامات وعالية الدقة قياس الطيف الكتلي بطريقة حلها في الوقت، وطريقة باليو-TimeCourse يسمح لتحليل ديناميكية من الجيل من المنتجات الببتيد. ويمكن استخدام الفحص لتوليد مستقرة الببتيدات المسمى isotopically للدراسات البروتيوميات الكمية والنوعية وتقييم حركية التي يتم إنشاؤها الببتيدات proteotypic. وعلاوة على ذلك، تم تصميم باليو-TimeCourse لتقييم مسارات محددة تحت بروتين، ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي السابقين الظروف. يمكن استخدامها البروتينات الذاتية، الببتيدات والبروتياز وكذلك الببتيدات الاصطناعية والبروتياز المؤتلف في سير العمل. ويمكن تعديل اعتمادا على رد فعل بروتين معين للتحقيق معهم، والظروف والأوقات الفحص اكتشاف لتوفير لأخذ العينات الأمثل للعملية التفاعل. في تجربتنا، فإنه من المفيد أن يتباطأ ردود الفعل أسفل بروتين (على سبيل المثال باستخدام تركيزات منخفضة الانزيم، وغرفةدرجة الحرارة) للسماح لفترات مريحة مثل أخذ العينات دليل منهجيات وضع العلامات مع غيرها من النظائر المستقرة، والانحرافات للقياسات التجريبية 18 نسبة O-التأسيس صغيرة - عادة أقل من 5٪ للقمم مع أيون إحصاءات كافية. ويمكن للبروتوكول الشاملة تكيف بسهولة مع الأشكال الأخرى مقايسة، على سبيل المثال فحص مجموعة كبيرة من ركائز تركيبية أو توصيف تجهيز بروتين من الببتيدات الذاتية من العينات البيولوجية المعقدة (على سبيل المثال، وسائل الإعلام خلية ثقافة وسوائل الجسم). أثبتنا سابقا كيف يمكن الواصلة للنهج باليو مع خطوة LC-الانفصال، وتستخدم لتحديد تكوين دينامية peptidome اللعابية الإنسان 9. التواقيع بروتين التي حددها باليو-TimeCourse تقديم الحقائق المهمة المتعلقة بخصوصية الركيزة للالبروتيني من الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن البيانات وقت حل ينتج أيضا معلومات الحركية. هذه المعرفة هي مفيدة بشكل خاص في التقييم من الببتيدات proteotypic للدراسات البروتيوميات الكمية، حيث الخيار من الببتيدات المستهدفة استنساخه وفيرة للغاية من الضروري 21. وبالمثل، وتحديد معدل منظم للالخطوات في مسارات بروتين هو من مصلحة العليا لتطوير العقاقير البروتيني القائم على الرواية. البروتياز هي عوامل أساسية في العديد من العمليات الفيزيولوجية وفي بعض الحالات المرضية (مثل الاضطرابات القلبية الوعائية، والأمراض العصبية، والسرطان) وهذه الملاحظات يمكن أن تفتح فرصا جديدة للتدخلات العلاجية. THE-اليو استراتيجية - حمض المحفزة وسم مجموعات الكربوكسيل - وتطبيقها بسهولة على الببتيدات الاصطناعية والذاتية لإنتاج مستقرة معايير ترميز isotopically. حركية التفاعل حمض المحفزة أبطأ بكثير من رد فعل إنزيم المحفزة. لذلك، لا بد من التجارب مخططة بعناية المقبلة. اليو-TimeCourse هو بديل منخفض التكلفة للمواد الكيميائية، والتمثيل الغذائي الاصطناعية م وسمethods المستخدمة حاليا في الدراسات البروتيوميات. يمكن رصد عملية وضع العلامات للتحقق من صحة أن 18 O-التأسيس التوصل إلى التوازن، التي يمكن أن تكون ميزة على غيرها من أساليب وضع العلامات النظائر مستقرة. في الختام، LEO-TimeCourse العمل الموصوفة هنا هي أدوات متعددة الاستخدامات التي يمكن أن تستخدم بشكل خلاق في كثير من النوعية والكمية الدراسات البروتيوميات وكذلك البحوث البروتيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR المنح 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
