Summary
Stabiele isotoop labeling workflows in dienst
Abstract
Stabiele isotopen zijn essentiële hulpmiddelen in biologische massaspectrometrie. Vroeger 18 O-stabiele isotopen uitgebreid gebruikt om de katalytische mechanismen van proteolytische enzymen 1-3 bestuderen. Met de komst van massaspectrometrie-based proteomics is het enzymatisch gekatalyseerde omzetting van 18 O-atomen stabiele isotoopverrijking water een populaire methode om kwantitatief vergelijken eiwitexpressieniveaus (beoordeeld door Fenselau en Yao 4, Miyagi en Rao 5 en Ye et al.. 6). 18 O-etikettering is een eenvoudige en goedkope alternatief voor chemische (bijv. iTRAQ, ICCAT) en metabole (bijv. SILAC) labelingstechnieken 7. Afhankelijk van de gebruikte protease kan 18 O-labeling leiden tot de opname van maximaal twee 18 O-atomen in de C-eindstandige carboxylgroep van de splitsing product 3 8. In onze Paleo (p rotease-a ssisted l Abeling e mploying 18 O-verrijkt water) de aanpassing van enzymatische 18 O-etikettering, we gebruik gemaakt van 50% 18 O-verrijkt water onderscheidend isotopen opleveren. In combinatie met hoge resolutie matrix-assisted laser desorptie ionisatie time-of-flight tandem massaspectrometrie (MALDI-TOF/TOF MS / MS) kan de kenmerkende isotoop enveloppen worden gebruikt splitsingsproducten identificeren met een hoge mate van specificiteit. Wij hebben al eerder gebruik hebben gemaakt van de paleo-methodiek op te sporen en te karakteriseren endogene proteasen 9 en bewaken proteolytische reacties 10-11. Sinds Paleo codeert de essentie van de proteolytische splitsing reactie, de experimentele opstelling is eenvoudig en biochemische Enrichment stappen van splitsingsproducten kunnen worden omzeild. De Paleo-methode kan eenvoudig worden uitgebreid met (i) het tijdsverloop experimenten die de dynamiek van de proteolytische splitsing reacties en (ii) de analyse van proteolyse in complexe biologische monsters die fysiologische omstandigheden vertegenwoordigen controleren. Paleo-tijdsverloop experimenten helpen identificeren van snelheidsbeperkende processtappen en reactie-intermediairen in complexe proteolytische route reacties. Bovendien is de paleo-reactie kunnen we vaststellen proteolytische enzymen zoals de serine protease trypsine die in staat zijn splitsingproducten opnieuw binden en de opname van een tweede 18 O-atoom katalyseren. Dergelijke "dubbele labeling" enzymen kunnen worden gebruikt voor postdigestion 18 O-labeling, waarbij peptiden uitsluitend gelabeld door de carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie. Onze derde strategie breidt etikettering gebruik 18 O-verrijkt water buiten enzymen en maakt gebruik van zure pH voorwaarden in te voeren 18 O-stabiele isotoop tekenperaturen in peptiden.
Protocol
De gepresenteerde LEO-workflows zorgen voor de stabiele isotoop etikettering van eiwit hydrolysaten en synthetische peptiden. Deze tijdsverloop experimenten (figuur 1) zijn van toepassing op vergelijkende en kwantitatieve proteomics studies en protease onderzoek. Elke workflow bestaat uit twee experimentele stappen (figuur 2): A) De tijd opgeloste bemonstering van de respectieve 18 O-stabiele isotoop-gecodeerde reactie (protease-gekatalyseerde splitsing peptide; protease gekatalyseerde carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie, carboxyl zuur gekatalyseerde zuurstofuitwisseling reactie) en B) analyse door massaspectrometrie en grafische representatie van 18 O-opname kinetiek.
A. tijdsverloop Experimenten
I. Paleo-tijdsverloop: Protease-gekatalyseerde etikettering van proteolytische splitsingen
- (Optioneel) Disulfidebindingen van eiwitten (10 uM) en peptiden (250 uM) worden gereduceerd met DTT (eindconcentratie 2,5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide vers bereid) door incubatie gedurende 30 min bij 50 ° C.
- (Optioneel) vrije cysteïnen worden gealkyleerd met joodacetamide (eindconcentratie 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 door incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Afhankelijk van protease van belang, eiwit / peptide-oplossingen moeten worden schoongemaakt-up om de resterende buffer en alkyleringsagens verwijderen. Gebruik PepClean C-18 spin-kolommen (Thermo) voor peptide opruimen en Vivaspin Centrifugaal Concentrators (Sartorius) om buffers te ruilen voor eiwit monsters.
- Voeg daarna / exchange peptiden / eiwitten in 20 pi protease reactiebuffer (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) bevattende 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
- Intrekken tijdstip nul monster voorafgaand aan de toevoeging van het protease: Mix 0,5 ul van het reactiemengsel en 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxycinnamicacid matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA). Steekproefmetingen op Opti-TOF 384 MALDI richtplaat (AB SCIEX) en het oplosmiddel druppels bij kamertemperatuur laten tot droog (ongeveer 5 min).
- Splits de reactieoplossing in twee hoeveelheden. De eerste aliquot wordt geïncubeerd met de protease plaats (ECE-1: 75 nM; trypsine: 0,04 nM) bij kamertemperatuur of de aanbevolen temperatuur voor het specifieke enzym. De tweede aliquot wordt geïncubeerd zonder protease en zal dienen als controlemonster. De eerste aliquot is een standaardmonster voor protease-gekatalyseerde 18 O-labeling en kan worden gebruikt voor peptide en proteïne-identificatie, detectie van proteolytische en bewaking van proteolytische splitsing reacties. Het tweede monster wordt gebruikt om aan te tonen dat 18 O-opname wordt geïnduceerd door de protease, dus noch labeling of splitsing verwacht voor dit voorbeeld.
- Volg de reactie door het verwijderen van reactie monsters en spotten ze als described onder stap 5 op tijdsintervallen als lijken fit. De reactiecondities hierboven beschreven worden gebruikt om een proteolytische reactie tot vier dagen (ca. 24 spots) te monitoren. Start bemonstering om de 5 min tot 30 min, vervolgens ter plaatse om de 30 min. tot 2 uur, vervolgens elk uur tot 8 uur en elke 8 uur tot 4 dagen. Splitsing producten moeten optreden binnen de eerste 12 uur en de ondergrond moet volledig worden gehydrolyseerd na 24 uur. Langere reactietijd incubatietijden laten stabiele reactieproducten die discrete van reactietussenproducten, die verder verwerkt definiëren. Afhankelijk vraagstelling en gegeven enzym-substraat paren zijn spotting tijden en incubatietemperatuur te moduleren optimale reactie sampling verzekeren.
- Na de laatste reactietijd punt is gespot of tussen de uitgebreide spotten intervallen, de MALDI richtplaat wordt voorgelegd aan MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven (deel B).
II. Paleo-tijdsverloop: Postdigestion etikettering van proteolytische termini
- (Optioneel) Disulfidebindingen van eiwitten (10 uM) en peptiden (250 uM) worden gereduceerd met DTT (eindconcentratie 2,5 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 (beide vers bereid) door incubatie gedurende 30 min bij 50 ° C.
- (Optioneel) vrije cysteïnen worden gealkyleerd met joodacetamide (eindconcentratie 10 mM) in 25 mM NH 4 HCO 3 door incubatie gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Afhankelijk van de protease van belang, eiwit / peptide-oplossingen moeten worden schoongemaakt-up om de resterende buffer en alkyleringsagens verwijderen. Gebruik PepClean C-18 spin-kolommen voor peptide opruimen en Vivaspin Centrifugaal Concentrators voor eiwit buffer uitwisseling.
- Voeg daarna / wisselen opgeruimde peptide producten / eiwitten in 20 pi reactiebuffer protease (bijvoorbeeld trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) en met protease vertering plaats afronding (bijvoorbeeld trypsine: 0,04 nM, 37 ° C, 12 uur).
- Cleanup splitsingsproducten met PepClean C-18 spin-kolommen. Deze stap elimineert overblijvende protease activiteiten.
- Voeg daarna / wisselen opgeruimde peptide producten in 20 pi protease reactiebuffer (trypsine: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) bevattende 1:1 (v / v) def H 2 18 O.
- Intrekken tijdstip nul monster voorafgaand aan de toevoeging van enzym: Mix 0,5 ul van het reactiemengsel en 0,5 pi alpha cyano-4-hydroxykaneelzuur matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA). Steekproefmetingen op een MALDI richtplaat en de solvent druppels bij kamertemperatuur tot droog (ongeveer 5 min).
- Splits de reactieoplossing in twee hoeveelheden. De eerste aliquot wordt geïncubeerd met protease van belang (bijvoorbeeld trypsine: 0,04 nM) bij kamertemperatuur of de aanbevolen temperatuur voor het specifieke enzym. Het tweede aliquot wordt geïncubeerd zonder protease en dient als een controle. Het eerstealiquot is een standaardmonster voor protease-gekatalyseerde 18 O-postdigestion labeling en kan worden gebruikt voor peptide en proteïne kwantificering. Het tweede monster wordt gebruikt om aan te tonen dat 18 O-opname wordt gekatalyseerd door het protease en daardoor kan geen labeling verwacht voor dit voorbeeld.
- Volg de reactie door het verwijderen van vlekken reactie aliquots ze als beschreven in stap 7.) Bij tijdsintervallen als lijken fit. Zo zagen we eerst elke 5 min tot 30 min en elke 15 min daarna naar de carboxyl zuurstofuitwisseling gekatalyseerd door trypsine controleren.
- Na de laatste reactietijd punt is gespot of tussen de verlengde spotten intervallen de MALDI richtplaat wordt voorgelegd aan MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven (deel B).
III. Aleo-tijdsverloop: Zuur-gekatalyseerde etikettering van carboxylgroepen
- Incubeer afzonderlijke peptiden (50 nM) met 1:1 (v / v) 18 O-verrijkte water in thij of afwezigheid (controle) 0,1% (v / v) trifluorazijnzuur final (totaal volume 30 ui).
- Sample de reactieproducten dagelijks gedurende 48 dagen door co-spotten 0,5 ul aliquot van het mengsel van alfa 0.5μl cyano-4-hydroxykaneelzuur matrix (10 mg / ml in 50% acetonitril, 0,1% TFA) rechtstreeks op een MALDI doel plaat.
- Tussen spotten tussenpozen en na het spotten van de uiteindelijke reactie tijdstip in te dienen MALDI doelplaat voor MALDI-TOF/TOF MS / MS-analyse zoals hieronder beschreven in hoofdstuk B.
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS Data Acquisition and Analysis
- Massaspectra worden verkregen op een resolutie van 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Voor de analyse, wordt het instrument gekalibreerd met een mengsel van peptide standaarden (massastandaarden Kit voor kalibratie van AB SCIEX TOF / TOF instrumenten) met een maximale massa meetfout van ± 50 ppm en een minimum aantal van zes pieken te passen.
- MS spectra (massabereik400 - 4000 m / z) worden verworven in drievoud met positieve ionmodus met instelbare laserintensiteit (3.400 - 3.800; stapgrootte 50) met een aanvaardbare base piekintensiteit bereik van 2.000 - 45.000. Enkele shots worden verworven voor sub-spectra, met 400 totaal shots / spectrum, stop voorwaarden treden in werking na 800 sub-spectra worden verworven (slagen of zakken) of 400 deelspectra pas acceptatiecriteria. Bij lage overvloedig monsters of in aanwezigheid van complexe biologische achtergronden het ondereinde van het MS detectiebereik worden verhoogd tot 800 m / z. Bovendien kan het nodig zijn zout en andere storende verbindingen te verwijderen met een monster opruimstap zoals eerder beschreven of door LC scheiding.
- MS-gegevensbestanden (. T2D-bestanden) worden uitgevoerd uit de 4000-serie Explorer data-acquisitie software en geïmporteerd in ons eigen laboratorium informatie systeem, dat MASCOT Distiller software (Matrix Science) voor spectrale verwerking en piek detectie maakt gebruik van. Isotopische enveloppendeconvoluted zijn en 18 O-opname verhoudingen automatisch bepaald met behulp van een algoritme vergelijkbaar met die beschreven door Mason et al.. 12 en aangepast door onze groep 9. alternatief software zoals ZoomQuant 13 en Viper 14, alsmede commerciële software pakketten, als BioWorks Xpress (Thermo Fisher Scientific) en Mascot Distiller Kwantificering Toolbox (Matrix Science) kan deconvolute 18 O-type data 15,16. 18 O-incorporatie verhoudingen zijn uitgedrukt als de relatieve bijdragen van de afzonderlijke peptide isotoop soorten (dwz, peptiden met 16 O, 18 O 18 O 1 of 2) de gehele isotopische envelop.
- Voor elk experiment tijdsverloop, de molecuulmassa's ([M + H] +) voor alle gevonden peptide soorten uit de bijbehorende gegevensbestanden MS en de waarden weggegooid op 100 ppm massa breedte.
- Eent minste drie [M + H] + zijn ingesteld om te worden verplicht om een bak te vullen. Bij bekende substraten, wordt de gefilterde bin lijst vergeleken met een lijst van proteolytische splitsingsproducten voorspeld uit het substraat peptidesequentie met het ExPASy FindPept gereedschap 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) en een 200 ppm massa fout acceptatie tolerantie.
- MS / MS spectra worden verworven voor alle massa van splitsingsproducten voorspeld door de FindPept tool en voor bin waarden die 18 O-oprichtingen verband met hen te hebben. MS / MS-gegevens worden verkregen over de 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer in 1kV reflector positieve ion-modus, met een vaste laser intensiteit van 4200 en CID-gas in uit-stand. 50 schoten worden verworven in een gerandomiseerde patroon per sub-spectra tot een totaal van 40 sub-spectra per spot (wat een totaal van 2.000 schoten / spot).
- MS / MS-gegevens-bestanden (. T2D-bestanden) worden uitgevoerd uit de 4000-serie Explorer data-acquisitie software en geïmporteerd in ons eigen laboratorium informatie systeem, worden pieken gedetecteerd en MS / MS piek lijsten zijn gekoppeld aan de corresponderende prullenmand MS-gegevens.
- Voor peptide identificatie, zijn MS / MS piek lijsten gezocht tegen de SwissProt database met behulp van de MASCOT zoekmachine met de volgende zoekparameters: geen enzym specificiteit, 150 ppm precursorion en 0,2 Da fragment ion mass toleranties.
- Peptide identificaties kunnen bovendien worden gevalideerd met behulp van de Data Explorer software (AB SCIEX) door de bevestiging van de karakteristieke 18 O-opname patronen in y-serie fragmentionen zoals beschreven door Shevchenko et al.. 18.
C. Bereiding van het spectrale Time en 18 O-incorporatie Plots
Spectrale tijd plots: MS-gegevensbestanden (. T2D bestanden) voor elke reactie tijdstip worden uitgevoerd uit het Data Explorer software als ASCII-bestanden met behulp van eenmacro en geïmporteerd in een data-analyse en grafische software programma (bijvoorbeeld Herkomst OriginLab) en weergegeven als waterval plots (Figuur 3).
18 O-opname plots: Voor elke weggegooid peptide splitsingsproduct, de relatieve bijdrage van afzonderlijke peptide isotoop soorten (16 O, 18 O 18 O 1 of 2) geëxtraheerd alle reactietijd punten en uitgezet tegen de tijd (Figuur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten de paleo-tijdsverloop workflow voor het dynamisch toezien op de integratie van 18 O-stabiele isotopen in peptide splitsingsproducten gegenereerd door proteolytische enzymen. De gepresenteerde aanpak is een veelzijdige tool om relatief proteolytische processing paden te bestuderen voor verschillende ondergrond en protease combinaties. Door het bemonsteren proteolytische reacties herhaaldelijk over het verloop van de reactie, de paleo-tijdsverloop experiment biedt tijdsopgeloste snapshots van substraat en product abundanties en verwerken details. Co-spotten monsters met zure matrix oplossing op een target bord stopt de enzymatische reactie en matrix kristallisatie verdere samenstelling van de steekproef behouden. Daarom kan tijdstippen achteraf worden geanalyseerd door MALDI-TOF/TOF MS / MS na het sluiten van de enzymatische reactie. Om de gegevens-rijke karakter van deze experimentele workflows tegemoet te komen, implementeerden we een semi-automatische bioinformatica systeem dat 18 O-incorporat berekentionen per peptide. Figuur 3 toont een representatieve spectrale tijdsverloop plot van de verwerking van peptide Endokinin C door ECE-1. Paleo-tijdsverloop data multidimensionaal: is de inhoud van het MS data over het gehele massabereik tegelijkertijd toont de relatieve hoeveelheden van de peptide substraat en de relatieve hoeveelheden van de producten peptide. De temporele opstelling maakt ontcijferen de volgorde van splitsing en het bepalen welke gebeurtenissen peptidefragmenten stabiel splitsingsproducten. De ingezoomde weergave van het MS data onthult de isotoop enveloppen van elk peptide en splitsing geïnduceerde 18 O-labeling wordt gemakkelijk geïdentificeerd door zijn karakteristieke isotoop verdeling. 18 O-labeling maakt positieve selectie van splitsingsproducten voor latere identificatie door MS / MS. Al met al, de paleo-tijdsverloop test vangt de dynamiek van proteolytische verwerking en maakt het mogelijk de evaluatie bij voorkeur splitsingsplaatsen van proteasen. Maar een ander niveau van informatieinformatie kan worden verkregen, afhankelijk van de enzymatische mechanisme van het gebruikte protease. Bepaalde proteasen zoals het serine protease trypsine kunnen covalent herbinden de peptide splitsingsproducten. . De hydrolyse van het acylenzym tussenresultaten in de opname van een tweede 18 O-atoom in de C-eindstandige carboxylgroep Figuur 4 toont de resulterende veranderingen in de relatieve bijdrage van de verschillende isotopomeren tijd: De eerste peptidebinding splitsingsreactie resulteert in een 1:1 splitsing tussen de 16 en 18 O O 1 peptidefracties. De carboxyl zuurstoftoevoer reactie resulteert in de toename van de 18 O 2 fractie en de verhouding 25% bij evenwicht met een gelijktijdige verlaging van de 16 O fractie. Proteasen kan katalyseren de carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie kan derhalve worden gebruikt tegen 18 O-labeling workflow de postdigestion etikettering van proteolytische termini. In dit soort experimenten zijn substraten eerst gedigereerd in afwezigheid van H 2 18 O, peptide producten schoongemaakt en geïncubeerd met een vers portie protease, maar deze keer in de aanwezigheid van 50% 2 18 H O. Figuur 4 toont de verschillen in opname isotoop die kan worden waargenomen in beide experimentele workflows en de verschillen in snelheid tussen individuele opname peptidesubstraten. In de postdigestion etikettering workflow, wordt het tarief voor zowel 18 O-oprichtingen bepaald door de carboxyl zuurstof-uitwisseling. De reactie is afhankelijk van hoe snel de protease reageert met de splitsingsproducten. De affiniteit voor het reactieproduct kan indirect worden gebruikt om de affiniteit van de protease afgeleid van de oorspronkelijke peptide substraat. Dergelijke informatie kan nuttig zijn om te bepalen welke peptidesequenties ideaal substraten bijvoorbeeld voor tryptische digesties in kwantitatieve proteomics studies. Peptides die gemakkelijk worden gesplitst en dubbel gelabeld door trypsine waarschijnlijk proteotypic peptiden die reproduceerbaar en kwantitatief gevormd en daarom ideaal voor vergelijkende studies proteomics.
Bij lage pH, zuurstoffen carbonzuurgroepen uitwisseling met het waterige oplosmiddel 19-20. Deze reactie kan worden gebruikt als een alternatieve benadering protease gekatalyseerde etikettering strategieën om stabiele isotopen introduceren in peptiden. In de Aleo-tijdsverloop (zuur-gekatalyseerde etikettering gebruik 18 O-verrijkt water) workflow, we volgden de trage opname van 18 O-atomen in synthetische peptiden. Het zuur-gekatalyseerde uitwisseling zuurstof gestopt na co-kristallisatie met de matrix oplossing op de MALDI richtplaat effectief "bevriezen" van de isotoop verdeling staat. We gebruikten Angiotensine 1 als een model peptide en onderzocht de isotoop envelope tijd (Figuur 5). Een opname van twee 18 O-atomen voor elke autoboxyl groep werd waargenomen. Onder de huidige experimentele omstandigheden, de zuur gekatalyseerde carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie was veel langzamer dan de protease-gekatalyseerde uitwisseling 9 en evenwicht bereikt na 48 dagen. De Aleo benadering biedt het voordeel etikettering peptiden die niet worden herkend door proteasen. Bovendien nemen meerdere peptiden 18 O-atomen afhankelijk van het aantal zure zijketens, wat kan resulteren in volledige scheiding van de isotopen enveloppen van ongelabelde en gelabeld soorten. De totale massa verschuiving geeft informatie over het aantal zure residuen in een bepaalde peptide en de plaats kan worden verkregen door de analyse van MS / MS fragment ion mass verschuivingen. 18 O-gemerkte peptiden weer bijna identieke chromatografische gedrag als ongelabelde tegenhangers, die in staat stelt hun vergelijkende analyse op identieke elutietijd. Samengevat, zuur-gekatalyseerde 18 O-labeling kan dienen als alternatief voor chemische, enzymatic en metabole etikettering benadert vaak gebruikt in kwantitatieve proteomics. Een bijzonder veelbelovende toepassing van deze techniek is het gebruik van 18 O-gelabelde peptiden stabiele isotopen normen.
Figuur 1. 18 O-based labeling biedt een verscheidenheid aan tijdsverloop workflows. (I) De protease-gekatalyseerde Paleo-tijdsverloop workflow zorgt voor de monitoring van de dynamiek van de proteolytische splitsing reacties. Afhankelijk van de protease, deze reacties resulteren in (a) enkel (bijvoorbeeld in het geval van bepaalde metalloproteasen) of (b) dubbele 18 O-incorporatie (bijv. in het geval van bepaalde serine proteasen). (II) Dubbel 18 O-labeler dergelijke zoals trypsine kan ook worden gebruikt in postdigestion labeling workflows, waarin 18 O-opname uitsluitend gemedieerd door het protease gekatalyseerdecarboxyl zuurstof-uitwisseling. (III) In tegenstelling tot de Aleo-tijdsverloop workflow is gebaseerd op de zuur-gekatalyseerde carboxyl zuurstof uitwisseling reacties van zure peptide kant en eindgroepen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Experimentele workflows van de paleo-en Aleo-tijdsverloop strategieën. A) (I) In een protease gekatalyseerde paleo-tijdsverloop experiment substraten geïncubeerd met een protease in de aanwezigheid van H2 18 O resulteert in de opname van maximaal twee 18 O-atomen afhankelijk van de protease. (II) In een Paleo postdigestion labeling experiment worden splitsingsproducten van een eerdere digestie opnieuw geïncubeerd met een protease plaats in aanwezigheid van H 2 18 O. Proteasen in staat om dubbele etikettering (in workflow I) zal katalyseren de integratie van twee 18 O-atomen. (III) in een zuur-gekatalyseerde Aleo experiment, alle zure functionele groepen bevatten 18 O-atomen B) tijdsverloop Analysis:.. Op getimede intervallen, porties van de reactiemengsels samen gespot met matrix op MALDI-target afmetingen op MS- data-acquisitie, spectrale tijd percelen van het peptide splitsingsreacties en 18 O-opname plots van afzonderlijke peptide-soorten worden gegenereerd en decollete producten worden geselecteerd voor MS / MS-gebaseerde sequence identificatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
pload/3891/3891fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Spectral tijd plots toont de dynamiek van proteolytische splitsing reacties. Door het uitzetten MS spectra van paleo-tijdsverloop experimenten in een waterval opstelling is het mogelijk om gelijktijdig controleren de afbraak van het substraat en het ontstaan van intermediaire en definitieve splitsingsproducten. Hier de splitsing van het bioactieve peptide Endokinin C door Endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1) getoond. Splitsingsproducten werden geïdentificeerd door MS / MS en hun bijbehorende isotopen enveloppen weergegeven de karakteristieke 18 O-incorporatie handtekeningen (rood gemarkeerd).
Figuur 4. Serine proteasen zoals trypsine bemiddelen de opname van maximaal twee 18 O-atomen in peptide splitsingsproducten. (I) trong> In de protease-based labeling workflow de peptidebinding splitsingsreactie resulteert in een 50% enkele 18 O-verhouding voor incorporatie vers gegenereerd peptide splitsingsproducten (zwarte stippen geven unlabeled, rood single-gelabelde peptide fracties). Proteasen die hun reactie producten (bijvoorbeeld serine proteasen zoals trypsine) opnieuw binden verder katalyseren de omzetting van een tweede 18 O-atoom via de carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie (groene stippen dubbel gelabelde peptide fractie). Bij evenwicht, een label verdeling van 0.25:0.5:0.25. (Un-, enkel-, dubbel-gelabeld) is bereikt (II) In de postdigestion etikettering van proteolytische termini workflow, geen peptidebinding splitsingen optreden. In plaats daarvan wordt de opname van maximaal twee 18 O-atomen uitsluitend steunt op een carboxyl zuurstof uitwisselingsreactie. Daarom 18 O-opname zich slechts bij proteases die hun peptide splitsingsproducten opnieuw binden.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Zuur gekatalyseerde 18 O-labeling leidt tot de opname van twee 18 O-atomen per carboxylgroep. De loop van het experiment de isotopische envelop van angiotensine-1 +2 multiple Da massa verschuivingen (stippellijnen) voor de opname ondergaan 18 O-atomen. De sites van 18 O-opname worden gemarkeerd in de aminozuursequentie (blauw).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door het combineren van stabiele isotopen labeling en hoge resolutie massaspectrometrie in een tijdsopgeloste wijze de paleo-tijdsverloop werkwijze maakt een dynamische analyse van de vorming van peptide producten. De test kan worden gebruikt om stabiele isotoop gemerkte peptiden voor kwantitatieve en kwalitatieve proteomics studies genereren en de kinetiek waarbij proteotypic peptiden gegenereerd evalueren. Bovendien wordt paleo-tijdsverloop ontworpen om proteolytische systemen evalueren onder specifieke, fysiologisch relevante omstandigheden ex vivo. Endogene eiwitten, peptiden en proteasen en synthetische peptiden en recombinante proteasen kunnen worden gebruikt in de workflow. Afhankelijk van de specifieke proteolytische reactie te onderzoeken, bepalingsomstandigheden en spotten tijden kunnen worden ingesteld in een optimale bemonstering van de reactie. In onze ervaring, is het nuttig te vertragen proteolytische reacties (bijv. door het gebruik van lage enzymconcentraties, kamertemperatuur) om voor gemakkelijk handmatig samplingintervallen Zoals met andere stabiele isotopen labeling methoden afwijkingen voor de experimentele 18 O-opname-verhouding metingen kleine -. typisch minder dan 5% van pieken voldoende ion statistieken. Het algemene protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere assay formats, bijvoorbeeld het screenen van een grote reeks synthetische substraten of de karakterisering van de proteolytische processing van endogene peptiden uit complexe biologische monsters (bijvoorbeeld celkweek media, lichaamsvloeistoffen). We hebben eerder aangetoond hoe de paleo-benadering kan worden afgebroken met een LC-scheidingsstap, en gebruikt om de dynamische samenstelling van het menselijk speeksel peptidoom 9 bepalen. Proteolytische handtekeningen die de paleo-tijdsverloop verschaffen belangrijke gegevens betreffende de substraatspecificiteit van de protease van belang. Bovendien de tijdsopgeloste data levert ook kinetische informatie. Deze kennis is bijzonder nuttig bij de evaluatie van proteotypic peptiden voor kwantitatieve proteomics studies, waarbij de keuze van reproduceerbare en zeer overvloedig targetpeptiden essentieel 21. Ook identificeren snelheidsbeperkende stappen in proteolytische systemen is van groot belang voor de ontwikkeling van nieuwe protease gebaseerde geneesmiddelen. Proteasen zijn belangrijke factoren in vele fysiologische en pathologische processen (bijvoorbeeld hart-en vaatziekten, neurodegeneratieve ziekten, kanker) en dergelijke opmerkingen kunnen leiden tot nieuwe kansen voor therapeutische interventies. De Aleo-strategie - zuur-gekatalyseerde etikettering van carboxylgroepen - is makkelijk aan te synthetische en endogene peptiden aan stabiele isotopen gecodeerd normen. De kinetiek van de zuur gekatalyseerde reactie veel trager dan de enzym-gekatalyseerde reactie. Daarom experimenten moeten vooruit zorgvuldig worden gepland. Aleo-tijdsverloop is een low-cost alternatief voor de chemische, metabole en synthetische etikettering methoden momenteel in proteomics studies. De etikettering proces kan worden gecontroleerd om te bevestigen dat 18 O-incorporatie evenwicht, wat een voordeel ten opzichte van andere stabiele isotoop labeling methoden worden bereikt. Kortom, de Leo-tijdsverloop workflows hier beschreven zijn veelzijdige tools die creatief kan worden gebruikt in tal van kwalitatieve en kwantitatieve proteomics studies en protease onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NIDCR Grant 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
- Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
- Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
- Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
- Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
- Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
- Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
- Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
- Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
- Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
- Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
- Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156 (2009).
- Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
- Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
- Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
- Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
- Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
- Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
- Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
- Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).
