Summary
Isotopi stabili flussi di lavoro in materia di etichettatura che impiegano
Abstract
Isotopi stabili sono strumenti essenziali in spettrometria di massa biologica. Storicamente, 18 O-isotopi stabili sono stati ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi catalitici di enzimi proteolitici 1-3. Con l'avvento di spettrometria di massa a base di proteomica, la enzimaticamente catalizzata incorporazione di 18 atomi di O-da stabile l'acqua arricchita con isotopi è diventato un metodo popolare per confrontare quantitativamente i livelli di espressione di proteine (recensione da Fenselau e Yao 4, Miyagi e Rao 5 e Ye et al. 6). 18 O-etichettatura costituisce un'alternativa semplice ea basso costo per chimica (ad esempio iTRAQ, ICAT) e metaboliche (es. SILAC) tecniche di etichettatura 7. A seconda della proteasi utilizzato, 18 O-etichettatura può provocare l'incorporazione di fino a due atomi di O-18 nel C-terminale gruppo carbossilico del prodotto di scissione 3 8. Nel nostro Paleo (p rotease-a ssisted e Abeling l mploying 18 O arricchita di acqua) l'adeguamento delle enzimatica 18 O-etichettatura, abbiamo utilizzato il 50% 18 O arricchita di acqua per ottenere le firme isotopiche distintive. In combinazione con alta risoluzione matrix-assisted laser ionizzazione desorbimento tempo di volo spettrometria di massa tandem (MALDI-TOF/TOF MS / MS), le buste isotopici caratteristici possono essere utilizzati per identificare prodotti di taglio con un elevato grado di specificità. Abbiamo in precedenza hanno usato il Paleo-metodologia per individuare e caratterizzare proteasi endogene 9 e monitorare le reazioni proteolitici 10-11. Poiché Paleo codifica l'essenza stessa della reazione taglio proteolitico, la configurazione sperimentale è enri semplice e biochimichepassi chment di prodotti di dissociazione può essere aggirato. Il Paleo-metodo può essere facilmente esteso per esperimenti di tempo (i) del corso che controllano la dinamica delle reazioni taglio proteolitico e (ii) l'analisi della proteolisi in campioni biologici complessi che rappresentano le condizioni fisiologiche. Paleo-TimeCourse esperimenti di aiuto per identificare il tasso di limitazione fasi di lavorazione e prodotti intermedi di reazione in complesse reazioni pathway proteolitici. Inoltre, il paleo-reazione ci permette di identificare enzimi proteolitici come la tripsina serina proteasi che è in grado di associare nuovamente i suoi prodotti di scissione e catalizzare l'incorporazione di un secondo 18 O-atomo. Tali "doppio" etichettatura enzimi possono essere usati per postdigestion 18 O-etichettatura, in cui i peptidi sono etichettati esclusivamente dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La terza strategia si estende l'etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua al di là degli enzimi e utilizza condizioni di pH acido per introdurre 18 O-stabile segno isotopoture in peptidi.
Protocol
Le presentati leo-flussi di lavoro consentono una etichettatura degli isotopi stabili di proteine e peptidi sintetici digerisce. Questi esperimenti tempo (Figura 1) sono applicabili a comparativi e quantitativi studi di proteomica e la ricerca della proteasi. Ogni flusso di lavoro è costituito da due fasi sperimentali (Figura 2): A) Il tempo di campionamento risolta del rispettivo 18 O-isotopi stabili con codifica reazione (proteasi-catalizzata clivaggio peptide; proteasi-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno, acido-catalizzata scambio di ossigeno carbossilico reazione) e B) analisi mediante spettrometria di massa e la rappresentazione grafica di 18-O incorporazione cinetica.
A. TimeCourse Esperimenti
I. Paleo-TimeCourse: Proteasi-catalizzata etichettatura dei cleavages proteolitici
- (Opzionale) legami disolfuro di proteine (10 mM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale 2.5 mM)in 25 mM NH 4 HCO 3 (sia preparata) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C.
- (Facoltativo) cisteine libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- A seconda della proteasi di interesse, di proteine / peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare PepClean colonne C-18 di spin (Thermo) per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori (Sartorius) per scambiare i buffer per campioni di proteine.
- Ridisciogliere / peptidi / proteine di cambio in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (ECE-1: 50 mM MES-KOH, pH 5,5; tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 18 O (95%, Sigma Isotec).
- Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell'aggiunta della proteasi: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamicoacido matrice (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Caricare il campione su un Opti-TOF 384 piastra segnale MALDI (AB SCIEX) e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 minuti).
- Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con la proteasi di interesse (ECE-1: 75 nM; tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura raccomandata per il particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come campione di controllo. La prima aliquota rappresenta un campione standard di proteasi-catalizzata 18 O-etichettatura e può essere utilizzato per l'identificazione di peptidi e proteine, rilevamento di attività proteolitiche e monitoraggio delle reazioni di scissione proteolitica. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è indotta dalla proteasi, quindi, né etichettatura né scissione è prevista per questo esempio.
- Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come described sotto passaggio 5 a intervalli di tempo, come sembra in forma. Le condizioni di reazione descritte sopra sono usati per controllare una reazione proteolitica fino a quattro giorni (circa 24 punti). Avviare il campionamento ogni 5 min fino al 30 min, quindi individuare ogni 30 minuti fino a 2 ore, poi ogni ora fino a 8 ore e ogni 8 ore fino a 4 giorni. Prodotti di scissione dovrebbe apparire entro i primi 12 ore e il supporto deve essere completamente idrolizzato dopo 24 ore. Estesa tempi di incubazione di reazione permettono di definire i prodotti di reazione stabili che sono discreti da intermedi di reazione, che vengono ulteriormente elaborati. Seconda domanda di ricerca e di proposta enzima-substrato coppie, i tempi di individuazione e temperatura di incubazione devono essere modulata per assicurare campionamento ottimale reazione.
- Dopo l'ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistamento, la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B).
II. Paleo-TimeCourse: Postdigetichettatura estion di Termini proteolitici
- (Facoltativo) legami disolfuro di proteine (10 pM) e peptidi (250 mM) sono ridotte con DTT (concentrazione finale di 2,5 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 (entrambi preparati) mediante incubazione per 30 minuti a 50 ° C.
- (Facoltativo) cisteine libere sono alchilata con iodoacetamide (concentrazione finale 10 mM) in 25 mM di NH 4 HCO 3 mediante incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- A seconda della proteasi di interesse, di proteine / peptidi soluzioni devono essere ripulito per eliminare i residui di tampone e agente di alchilazione. Utilizzare le colonne PepClean C-18 di spin per la pulizia peptide e Vivaspin centrifuga Concentratori per lo scambio delle proteine buffer.
- Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici / proteine in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi tripsina (es: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) e digerire con proteasi di interesse al completamento (es. tripsina: 0,04 nM; 37 ° C, 12 ore).
- Scissione Cleanup con colonne PepClean C-18 di spin. Questo passo sarà eliminare le attività residue della proteasi.
- Ridisciogliere / scambiare gli ripulito prodotti peptidici in 20 microlitri di buffer di reazione proteasi (tripsina: 25 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0) contenente 1:1 (v / v) def H 2 O. 18
- Prelevare un campione di zero punto temporale prima dell'aggiunta di enzima: Mix 0,5 microlitri della miscela di reazione e 0,5 microlitri alpha ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% di TFA). Spot campione su una piastra MALDI e lasciare le goccioline di solvente a temperatura ambiente fino a secco (circa 5 min).
- Dividere la soluzione di reazione in due aliquote. La prima aliquota viene incubato con proteasi di interesse (ad esempio tripsina: 0,04 nM) a temperatura ambiente o la temperatura consigliata per la particolare enzima. La seconda aliquota sarà incubata senza proteasi e servirà come controllo. Il primoUn'aliquota rappresenta un campione standard per proteasi-catalizzata 18 O-postdigestion etichettatura e può essere utilizzato per la quantificazione delle proteine e peptidi. La seconda aliquota è usato per mostrare che il 18 O-incorporazione è catalizzata dalla proteasi, pertanto, alcuna etichettatura è prevista per questo esempio.
- Seguire la reazione rimuovendo aliquote di reazione e spotting come descritto al punto 7.) Ad intervalli di tempo, come sembra in forma. Per esempio, abbiamo scoperto inizialmente ogni 5 minuti fino a 30 minuti e ogni 15 minuti dopo che per monitorare il carbossile reazione di scambio di ossigeno catalizzata da tripsina.
- Dopo l'ultimo punto di tempo di reazione è macchiata o tra lunghi intervalli di avvistare la piastra di mira MALDI è sottoposto a MALDI-TOF/TOF MS / MS come descritto di seguito (sezione B).
III. Aleo-TimeCourse: acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici
- Incubare singoli peptidi (50 nM) con 1:1 (v / v) 18 O-acqua arricchita in tegli presenza o assenza (controllo) del 0,1% (v / v) finale di acido trifluoroacetico (volume totale 30 microlitri).
- I prodotti di reazione del campione al giorno per 48 giorni per co-spotting una aliquota 0,5 microlitri della miscela con 0.5μl di alfa ciano-4-idrossicinnamico matrice di acido (10 mg / ml in 50% acetonitrile, 0,1% TFA) direttamente su un bersaglio MALDI piastra.
- Tra gli intervalli di spotting e dopo aver individuato il punto finale tempo di reazione presenta una piastra segnale per MALDI-TOF/TOF MALDI MS / MS, come descritto di seguito nella sezione B.
B. MALDI-TOF/TOF MS / MS di acquisizione dati e analisi
- Gli spettri di massa sono invece acquistati su MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer (AB SCIEX).
- Prima dell'analisi, lo strumento è tarato con una miscela di standard peptide (Messa Kit standard per la calibrazione di AB SCIEX TOF / TOF strumenti), con una tolleranza massima di errore di massa di misura di ± 50 ppm e un numero minimo di sei picchi da abbinare.
- MS (range di massa400 - 4.000 m / z) sono acquisiti in triplice copia utilizzando la modalità di ioni positivi con una intensità del laser regolabile (3.400 - 3.800; passo di 50) con un accettabile campo di intensità base del picco di 2.000 - 45.000. Scatti singoli vengano acquistate per sub-spettri, con 400 colpi totali / spettro, stop condizioni entreranno in vigore dopo 800 sub-spettri vengono acquisiti (positivo o negativo) o 400 sub-spettri criteri di accettazione passaggio. In caso di bassa abbondanti campioni o in presenza di complessi ambienti biologici l'estremità inferiore del campo di rilevamento MS dovrebbe essere portato a 800 m / z. Inoltre, può essere necessario rimuovere sale e altri composti che interferiscono con un passo di pulitura campione come descritto in precedenza, o mediante separazione LC.
- MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla serie 4000 di acquisizione dati e software Explorer importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, che utilizza il software Distiller MASCOT (Matrix Science) per l'elaborazione spettrale e il rilevamento di picco. Buste isotopichesono deconvoluto e 18 O-incorporazione coefficienti determinati automaticamente utilizzando un algoritmo simile a quello descritto da Mason et al. 12 e adattato dal nostro gruppo 9. Alternativamente, strumenti software come ZoomQuant Viper 13 e 14, nonché pacchetti software commerciali quali come Bioworks Xpress (Thermo Fisher Scientific) e Mascot Distiller quantificazione Toolbox (Matrix Science) può deconvolute 18 O-tipo di dati 15,16. 18 O-incorporazione rapporti sono espressi come i contributi relativi delle singole specie isotopi peptide (cioè, peptidi contenenti almeno il 16 O, 18 O 18 O 1 o 2) per la busta isotopica.
- Per ogni esperimento TimeCourse, le masse molecolari ([M + H] +) per tutte le specie peptidiche rilevati vengono estratti dai file di dati associati MS ed i valori categorizzata in una larghezza 100 ppm di massa.
- Lat almeno tre [M + H] + sono impostati per essere tenuti a compilare un bidone. Nel caso di supporti noti, l'elenco bin filtrato viene confrontato con l'elenco dei prodotti di scissione proteolitica previsto dalla sequenza di peptide substrato utilizzando lo strumento ExPASy FindPept 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) e 200 ppm di massa tolleranza di errore di accettazione.
- MS / MS sono acquisiti per tutti i valori di massa dei prodotti di scissione previsti dallo strumento FindPept e per valori bin che hanno 18 O-incorporazioni essi associati. MS / MS dati sono stati acquisiti in MALDI 4800 TOF / TOF Analyzer in modalità riflettore 1 kV ione positivo, con una intensità del laser fissa di 4200 e CID-gas in modalità off. 50 scatti vengono acquisiti in un modello randomizzato per ogni sub-spettri fino a un totale di 40 sotto-spettri per spot (producendo un totale di 2.000 scatti / spot).
- MS / MS i file di dati (. T2D file) sono esportati dalla Serie 4000 Explorer software di acquisizione dati e importati nella nostra in-house sistema di laboratorio informazione, i picchi vengono rilevati e MS / MS liste di punta sono associati con i corrispondenti dati raggruppate MS.
- Per l'identificazione peptide, MS / MS liste di picco sono confrontati con il database SwissProt utilizzando il motore di ricerca MASCOT con i seguenti parametri di ricerca: nessuna specificità dell'enzima, 150 ppm di ione precursore e 0,2 Da frammento tolleranze di massa di ioni.
- Identificazioni peptidi possono inoltre essere convalidati utilizzando il software Data Explorer (AB SCIEX) confermando le caratteristiche 18 O-incorporazione modelli in tutto y serie frammenti ionici come descritto da Shevchenko et al. 18.
C. Preparazione del Tempo spettrale e 18 O-incorporazione Personaggi
Grafici spettrali tempo: MS file di dati (. T2D file) per ogni punto il tempo di reazione vengono esportati dal software Data Explorer come ASCII-file utilizzando unmacro e importato in un programma di analisi dei dati e software di grafica (ad esempio origine OriginLab) e visualizzati come grafici a cascata (Figura 3).
18 O-incorporazione piazzole: Per ogni prodotto peptide cestinate scissione, dei contributi delle singole specie isotopi peptide (16 O 18 O 18 O 1 o 2) vengono estratti attraverso punti di tutti i tempi di reazione e funzione del tempo (Figura 4).
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Representative Results
Abbiamo usato il Paleo-TimeCourse flusso di lavoro per monitorare in modo dinamico l'incorporazione di 18 O-isotopi stabili in prodotti di dissociazione peptidici generati dagli enzimi proteolitici. L'approccio presentato è uno strumento versatile per studiare comparativamente percorsi di elaborazione proteolitici per substrati diversi e combinazioni di proteasi. Campionando reazioni proteolitici ripetutamente nel corso della reazione, il paleo-TimeCourse esperimento fornisce istantanee risolta nel tempo di substrato e abbondanze prodotto e dettagli di elaborazione. Co-spotting campioni con una soluzione acida matrice su una piastra segnale si arresta la reazione enzimatica e cristallizzazione matrice conserva ulteriore composizione del campione. Pertanto, punti di tempo può essere analizzato retrospettivamente MALDI-TOF/TOF MS / MS dopo la conclusione della reazione enzimatica. Per ospitare i dati ricca di natura di questi flussi di lavoro sperimentale, abbiamo implementato un sistema semi-automatico bioinformatica che calcola 18 O-incorporapporti ionici per ciascun peptide. Figura 3 mostra un diagramma rappresentante spettrale decorso del trattamento di peptide C da Endokinin ECE-1. Paleo-TimeCourse dati multidimensionale: La vista espansa dei dati MS attraverso l'intero intervallo di massa mostra contemporaneamente le abbondanze del substrato peptidico così come le abbondanze dei prodotti peptidici. La disposizione temporale permette decifrare la sequenza di eventi scissione e determinare quali frammenti peptidici sono prodotti di scissione stabili. La vista ingrandita dei dati MS rivela le buste isotopi di ciascun peptide e scissione indotta 18 O-etichettatura è facilmente identificata dalla sua distribuzione isotopica caratteristica. 18 O-etichettatura consente la selezione positiva dei prodotti di clivaggio per la successiva identificazione da MS / MS. Complessivamente, il paleo-TimeCourse saggio cattura la dinamica della maturazione proteolitica e permette di valutare siti di taglio preferito di proteasi. Un altro livello di informazionizione può essere ottenuto a seconda del meccanismo enzimatica della proteasi utilizzato. Proteasi determinate come la tripsina serina proteasi sono in grado di covalentemente rilegame loro prodotti di clivaggio del peptide. . L'idrolisi dei risultati intermedi acil-enzimatiche nella incorporazione di un secondo 18 O-atomo del C-terminale carbossile figura 4 mostra le variazioni risultanti nel contributo relativo delle isotopomeri diverse nel tempo: Il primo legame peptidico reazione di scissione risultati in una frazione di 1:1 tra il 16 O e 18 O 1 frazioni peptidiche. I risultati carbossilici ossigeno reazione di scambio in aumento del 18 2 O frazione per il rapporto 25% in equilibrio con una concomitante diminuzione della frazione 16 O. Proteasi capace di catalizzare la reazione di scambio di ossigeno carbossile può quindi essere utilizzata per un ulteriore 18 O-etichettatura workflow, l'etichettatura postdigestion di proteolitica termini. In questi tipi di esperimenti, substrati sono inizialmente digeriti in assenza di H 2 18 O, prodotti peptidici ripulito e incubate con un nuovo lotto di proteasi, ma questa volta in presenza del 50% H 2 O. 18 La Figura 4 mostra l' differenze di incorporazione isotopi che possono essere osservati in questi due flussi di lavoro sperimentali e le differenze in termini di velocità di incorporazione tra substrati peptidici individuali. Nel workflow etichettatura postdigestion, il tasso per entrambi 18 O-incorporazioni è determinata dalla reazione carbossile scambio di ossigeno. La velocità di reazione dipende da quanto facilmente la proteasi interagisce con i suoi prodotti di scissione. L'affinità per il prodotto di reazione può indirettamente essere utilizzato per dedurre l'affinità della proteasi al substrato peptide originale. Tali informazioni potrebbero essere utili per determinare quali sequenze peptidiche sono substrati ideali ad esempio per digerisce trittico in quantitativi studi di proteomica. Peptides che sono prontamente spaccati e doppio marcato dalla tripsina sono probabilmente peptidi proteotypic che sono riproducibile e quantitativamente formate e quindi ideale per gli studi comparativi proteomica.
A pH basso, ossigeni dei gruppi di acido carbossilico di scambio con il solvente acquoso 19-20. Questa reazione può essere utilizzato come un approccio alternativo alla proteasi-catalizzata etichettatura strategie per introdurre isotopi stabili in peptidi. Nel Aleo-TimeCourse (acido-catalizzata etichettatura impiegando 18 O arricchita di acqua) del flusso di lavoro, abbiamo monitorato l'incorporazione lento del 18 O-atomi in peptidi sintetici. L'acido-catalizzata scambio di ossigeno si fermò dopo la co-cristallizzazione con la soluzione matrice sulla piastra segnale MALDI, in modo efficace "congelare" lo stato di distribuzione isotopica. Abbiamo usato angiotensina 1 come peptide modello ed esaminato il suo involucro isotopo nel tempo (Figura 5). Un assorbimento di due O-18 atomi per ogni autogruppo boxyl è stata osservata. Nelle condizioni sperimentali correnti, l'acido-catalizzata carbossilico reazione di scambio di ossigeno era molto più lenta della proteasi-catalizzata cambio 9 e raggiunto l'equilibrio solo dopo 48 giorni. Tuttavia, l'approccio Aleo offre il vantaggio di etichettatura peptidi che non sono riconosciuti da proteasi. Inoltre, i peptidi incorporare multipli 18 O-atomi a seconda del numero di catene laterali acide, che può risultare in completa separazione delle buste isotopi di specie non etichettati o etichettati. Lo spostamento di massa complessiva fornisce informazioni sul numero di residui acidi in un dato peptide e la loro posizione può essere derivato dall'analisi di MS / MS frammento spostamenti di massa di ioni. 18 O-peptidi marcati visualizzare pressoché identica comportamento cromatografico come le loro controparti non etichettati, che consente loro analisi comparativa in fase di eluizione identici. In sintesi, l'acido-catalizzata 18 O-etichettatura può servire come alternativa alla chimica, enetichettatura zymatic e metaboliche si avvicina comunemente utilizzati in proteomica quantitativa. Una particolare applicazione di questa tecnica promettente è l'uso di peptidi 18-O etichettati come standard isotopi stabili.
Figura 1. 18 O a base di etichettatura offre una vasta gamma di flussi di lavoro del corso di tempo. (I) La proteasi-catalizzata Paleo-TimeCourse workflow consente il monitoraggio della dinamica di reazioni scissione proteolitica. Seconda proteasi, Queste reazioni in (a) singolo (ad esempio nel caso di alcune metalloproteasi) o (b) matrimoniale 18 O-incorporazione (ad esempio nel caso di certe proteasi seriniche). (II) doppia 18 O-etichettatrice tale come tripsina può essere utilizzato anche in flussi di etichettatura postdigestion, in cui 18 O-incorporazione è esclusivamente mediata dalla proteasi-catalizzatacarbossile reazione di scambio di ossigeno. (III) Al contrario, la aleo-TimeCourse flusso di lavoro si basa sulle reazioni catalizzate da acidi carbossilici lo scambio di ossigeno di lato peptide acido e gruppi terminali. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Flussi di lavoro sperimentale dei paleo-e-aleo TimeCourse strategie. A) (I) In una proteasi-catalizzata Paleo-TimeCourse esperimento, i substrati vengono incubate con una proteasi in presenza di H 2 O 18 conseguente alla incorporazione di fino a due atomi di O-18 a seconda della proteasi. (II) In un esperimento etichettatura postdigestion Paleo, prodotti di taglio da una precedente digestione sono re-incubate con una proteasi di interesse in presenza di H 2 O. 18 Proteasi in grado di doppia marcatura (in flusso di lavoro I) catalizza l'incorporazione di due campi a 18 atomi di O-. (III) In un acido-catalizzata Aleo esperimento, tutti i gruppi funzionali acidi incorporare 18 atomi di O-B) Analisi TimeCourse:.. Ad intervalli prestabiliti, aliquote delle miscele di reazione sono co-macchiato con matrice MALDI-MS bersaglio piastre Upon- l'acquisizione dei dati, i grafici temporali spettrali delle reazioni di scissione del peptide così come 18 O-incorporazione appezzamenti di specie peptidi individuali sono generati e prodotti della scissione sono selezionati per MS / MS-based di identificazione sequenza. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 3. Trame temporali spettrali visualizzare la dinamica delle reazioni scissione proteolitica. Tracciando spettri MS di Paleo-TimeCourse esperimenti in una disposizione cascata, è possibile monitorare contemporaneamente la degradazione del substrato e la comparsa di prodotti di scissione intermedi e finali. Qui, il clivaggio del peptide bioattivo Endokinin C da endotelina-converting enzyme-1 (ECE-1) è mostrato. Prodotti di scissione sono stati identificati mediante MS / MS e le loro dotazioni isotopi visualizzati i caratteristici 18 O-incorporazione firme (evidenziati in rosso).
Figura 4. Serina proteasi quali tripsina mediare l'incorporazione di fino a due atomi di O-18 in prodotti di clivaggio del peptide. (I) > trong Nel proteasi flusso di lavoro basato etichettatura, il peptide obbligazionari reazione di scissione si traduce in una singola 50% 18 O-incorporazione rapporto di appena generati prodotti della scissione del peptide (punti neri indicano senza etichetta, rosso single-etichettati frazioni peptidiche). Proteasi che riassociare i loro prodotti di reazione (ad esempio serina proteasi quali tripsina) un'ulteriore catalizzare l'incorporazione di un secondo atomo di O 18 tramite la reazione di scambio di ossigeno carbossilico (punti verdi, doppio etichettato frazione peptidica). All'equilibrio, una distribuzione etichetta di 0.25:0.5:0.25. (Un-, a singolo, doppio-etichettati) è raggiunta (II) Nella etichettatura postdigestion di proteolitico termini di flusso di lavoro, non si verificano fratture legame peptidico. Invece, l'incorporazione di fino a due atomi di O-18 si basa esclusivamente sulla reazione carbossile scambio di ossigeno. Pertanto, 18 O-incorporazione avviene solo con proteasi che riassociare i loro prodotti di clivaggio del peptide.p_upload/3891/3891fig4large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 5. Catalizzata da acidi 18 O-etichettatura porta alla costituzione di due O-18 atomi per gruppo carbossilico. Nel corso dell'esperimento, la busta isotopica di angiotensina-1 ha subito più due turni di massa Da (linee tratteggiate) corrispondenti alla captazione del 18 O-atomi. I siti di 18 O-incorporazione sono evidenziate nella sequenza aminoacidica (blu).
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Discussion
Combinando etichettatura isotopo stabile e ad alta risoluzione spettrometria di massa in un tempo risolto modo, il paleo-TimeCourse metodo permette una analisi dinamica della generazione di prodotti peptidici. Il saggio può essere utilizzato per generare peptidi marcati con isotopi stabili per quantitativi e qualitativi studi di proteomica e di valutare la cinetica con cui vengono generati peptidi proteotypic. Inoltre, Paleo-TimeCourse è progettato per valutare percorsi proteolitici sotto specifica, fisiologicamente rilevanti ex vivo condizioni. Proteine, peptidi endogeni e proteasi nonché peptidi sintetici e proteasi ricombinanti possono essere utilizzati nel flusso di lavoro. A seconda del particolare reazione proteolitica da indagare, tempi e condizioni di saggio chiazze può essere regolato per fornire per campionamento ottimale del processo di reazione. Nella nostra esperienza, è utile per rallentare le reazioni proteolitici verso il basso (ad esempio utilizzando basse concentrazioni enzimatiche, cameratemperatura) per consentire intervalli convenienti manuali di campionamento, come con altri isotopi stabili-metodologie di etichettatura, per le deviazioni sperimentali 18 O-incorporazione misure del rapporto sono piccole -. generalmente inferiore al 5% per i picchi con le statistiche di ioni sufficienti. Il protocollo generale può essere facilmente adattato per altri formati di saggio, ad esempio, la proiezione di un grande insieme di substrati sintetici o la caratterizzazione del processamento proteolitico di peptidi endogeni da campioni biologici complessi (ad esempio, mezzi di coltura delle cellule, fluidi corporei). Abbiamo già dimostrato come la paleo-approccio può essere sillabato con un LC-separazione passo, e utilizzato per definire la composizione dinamica dell'essere umano peptidoma salivare 9. Firme proteolitici individuati dal paleo-TimeCourse fornire dati importanti per quanto riguarda la specificità di substrato della proteasi di interesse. Inoltre, i dati in tempo risolto produce anche informazioni cinetiche. Tale conoscenza è particolarmente utile nella valutazione di peptidi proteotypic per studi quantitativi proteomica, dove la scelta di peptidi desiderati altamente riproducibili e abbondante è essenziale 21. Analogamente, identificando rate-limiting passaggi percorsi proteolitici è di grande interesse per lo sviluppo di nuovi farmaci a base di proteasi. Le proteasi sono fattori chiave in molti processi fisiologici e patologici (ad esempio malattie cardiovascolari, le malattie neurodegenerative, cancro) e tali osservazioni possono aprire nuove opportunità per interventi terapeutici. La strategia-Aleo - acido-catalizzata etichettatura dei gruppi carbossilici - è di facile applicazione e di peptidi sintetici per la produzione endogena stabili standard isotopicamente codificati. La cinetica della reazione acido-catalizzata è molto più lento della reazione enzimatica catalizzata. Pertanto, gli esperimenti devono essere attentamente pianificato in anticipo. Aleo-TimeCourse è una alternativa a basso costo ad agenti chimici, metaboliche e sintetiche etichettatura metodi attualmente utilizzato in studi di proteomica. Il processo di etichettatura può essere monitorato per convalidare che 18 O-incorporazione raggiunto l'equilibrio, che può essere un vantaggio rispetto ad altri metodi di isotopi stabili etichettatura. In conclusione, i LeO-TimeCourse flussi di lavoro descritti qui sono strumenti versatili che possono essere impiegati in modo creativo qualitativi e quantitativi molti studi di proteomica e la ricerca della proteasi.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCR sovvenzione 1R01DE019796.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PepClean C-18 Spin Columns | Thermo | 89870 | |
| Opti-TOF 384 MALDI target plate | AB SCIEX | 1016629 | |
| 4800 MALDI TOF/TOF | AB SCIEX | ||
| Table 1. Materials | |||
| Alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990-1G-F | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A3294-10G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Acros | 16568-0050 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | 1149-5G | |
| Endothelin converting enzyme-1 (ECE-1) | R&D Systems | 1784-ZN | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Water-18O, 97 atom % 18O | Sigma Aldrich | 329878-1G | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
| Mass Standards Kit for Calibration of AB SCIEX TOF/TOF instruments | AB SCIEX | 4333604 | |
| Table 2. Reagents | |||
References
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