Summary
אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון
Abstract
היה מי שהציע כי שינויים בסידן תאי לתווך אינדוקציה של מספר הצורות חשובות של פלסטיות הסינפטית (הנחיית למשל, homosynaptic) 1. השערות אלה ניתן לבדוק על ידי ניטור שינויים בסידן תוך תאי ושינויים ביעילות הסינפטית בו זמנית. אנו מדגימים כיצד זה יכול להתבצע על ידי שילוב הדמית סידן עם טכניקות הקלטה תאיות. הניסויים שלנו מתנהלים בגנגליון buccal של Aplysia californica הרכיכה. הכנה זו כוללת מספר התכונות מועילות בניסוי: גרעינים ניתן להסיר בקלות מAplysia וניסויים להשתמש תאי עצב בוגרים המרכיבים קשרים סינפטיים רגילים ויש לי ערוץ הפצת יון רגילה. בשל שיעור הנמוך מטבולים של בעלי החיים והטמפרטורות הנמוכות יחסית (14-16 מעלות צלזיוס) שהנם טבעיים לAplysia, הכנות הן יציבות לפרקי זמן ארוכים.
> אף אוזן גרון "כדי לזהות שינויים בסידן חופשי תאי אנו משתמשים בגרסת impermeant התא של סידן אורנג' 2 אשר בקלות" נטען "לנוירון באמצעות iontophoresis. כאשר צבע אורך גל ניאון ארוך זה נקשר לסידן, עולה עוצמת קרינה. הסיד אורנג' יש תכונות מהירות הקינטית 3 ו, בניגוד לצבעי ratiometric (למשל, Fura 2), לא דורשות גלגל מסנן עבור הדמיה. זה די תמונה יציבה ופחות phototoxic מצבעים אחרים (למשל, Fluo-3) 2,4. כמו כל הלא ratiometric צבעים, סידן אורנג' מציין שינויים יחסיים בריכוז הסידן. אבל, מכיוון שלא ניתן להסביר את השינויים בריכוז צבע עקב טעינה ודיפוזיה, זה לא יכול להיות מכויל לספק ריכוז יוני הסידן מוחלט.במה, מיקרוסקופ זקוף, קבוע מתחם שמש לנוירונים תמונה עם מצלמה מסוגלת להקליט סביב 30 מסגרות לשנייה CCD. בAplysia הרזולוציה של הזמן הזההוא יותר ממספק כדי לזהות אפילו שינוי מושרה ספייק יחיד בריכוז הסידן התוך התאי. אלקטרודות שארפ משמשות בו זמנית כדי לגרום ולהקליט שידור סינפטי בנוירונים לפני וpostsynaptic מזוהים. בסיומו של כל משפט, תסריט מותאם אישית משלב נתוני ההדמיה electrophysiology ו. כדי להבטיח סינכרון ראוי אנו משתמשים דופק אור LED הרכוב בנמל המצלמה של המיקרוסקופ. מניפולציה של רמות הסידן presynaptic (למשל, באמצעות הזרקת EGTA תאית) מאפשרת לנו לבחון את השערות ספציפיות, הנוגע לתפקידו של הסידן תוך תאי בתיווך צורות שונות של פלסטיות.
Protocol
1. הכנה
- הרדם את החיה על ידי הזרקת תמיסת 75-100 מ"ל איזוטוני מגנזיום כלוריד. Aplysia אנו משתמשים להדמיה הן בדרך כלל 150-200 גרם והם מתקבלים ממרינוס המדעי.
- להצמיד את החיה המורדמת לצלחת מכוסית שעווה. מחטי מזרקים לעבוד היטב למטרה זו; טכניקות סטריליות אינן נחוצות. שימוש במלקחי ברוטו ומספריים רגילים עושה חתך ברגלו של בעל החיים ולחשוף את מסת buccal. אתר גנגליון buccal. בעזרת מספרי האביב ומלקחיים עדינים, בזהירות חופשיה גנגליון על ידי חיתוך את כל עצבי buccal.
- הסר את מרכז העצבים ולמקם אותו בצלחת מצופית Sylgard המכילה מי ים מלאכותי. הנח כמה סיכות חרקים דרך עצבי buccal לייצב גנגליון. Desheath גנגליון buccal באמצעות מלקחיים ומספריים ultrafine אביב, כדי לחשוף את תאי העצב להקלטה תאית. ואז שוב להצמיד גנגליון באמצעות כ 15 חרקים בסדר (דקותסיכות) utien. גנגליון חייב להיות מוחזק היטב במקומו כמו כל תנועה תהיה בעייתית במהלך ההדמיה.
2. הכן אלקטרודות
- משוך האלקטרודות באמצעות צינור נימי זכוכית עם נימה (למשל WPI TW100F-4) ומושך. הגדרות צריכות להיקבע בנפרד כדי ליצור אלקטרודות של ההתנגדות הנדרשת. כאשר התמלא M 3 KAC (יצטט אשלגן) התנגדות האלקטרודה שלנו היא בדרך כלל כ 10 MOhms אם האלקטרודות הן להיות משופעות, או כ 5 MOhms אם הצעד המשופע מושמט.
- מלא קבוצה אחת של אלקטרודות עם תמיסה המכילה KCl M 3 KAc/30 mM שימוש במזרק ומחט microfil. אלקטרודות אלה ישמשו לelectrophysiology.
- מלא סט שני של אלקטרודות עם צבע מחוון הסידן על ידי טבילת הקצה האחורי של האלקטרודה בצבע, בעבר מחדש עם כ. 40 מים מזוקקים μl לצבע 500μg. כאשר הקצה של האלקטרודה מלא, חזרה למלא כ 1/4 אינץ'בסופו של אלקטרודה עם 200 מ"מ KCl כדי להבטיח מגע חשמלי טוב.
- זה מועיל לפוע האלקטרודות, כמו זו מאפשרת הזרקת צבע ומקטינה על ידי חדירות הממברנה מרובות הניזק. אנו משתמשים beveler מותאם אישית שיוצר זרם של השעית מים / מלח אבקת אלומינה. אלקטרודה היא רכובה בבעל וקצו נכנס לזרם בזווית ° 45. התנגדות אלקטרודה מנוטרת באופן רציף והמשופעת הסתיים כאשר ההתנגדות מגיעה כ 5 MOhm לKAC אלקטרודות מלאות. האלקטרודות המלאות הצבע הם משופעים לכמות שווה של זמן ובדרך כלל יש התנגדויות של MOhm 15-20.
3. טוען דיי אינדיקטור סידן
- הנח את ההכנה על אסדת electrophysiology וחזותי לאתר נוירון presynaptic של עניין. רבים מהניסויים שלנו נעשים עם נוירון חושי זיהה מנוצל במהלך האכלה, 5 B21, 6. Positio הקבוע יחסיתn, גודל (~ 100 מיקרומטר), וצורתו המוארכת של סומה של B21 לעשות את זה קל לאתר.
- תשפד נוירון עניינים עם אלקטרודה המכילה צבע מחוון סידן. זהותו של B21 יכולה להיות מאומתת על ידי impaling נוירון B8 הפוסט סינפטי. שלילת קוטביות של B21 עם 8 ~ נוכחי Na תפעיל קוצים ואת התוצאה בהנחיית PSPs ב7 B8.
- מזריק צבע בנוירון presynaptic של עניין על ידי העברת פולסים hyperpolarizing (בדרך כלל -15 Na, 1 הרץ, 75% המחזור) למשך כ 30 דקות. אם טעינת צבע היא מוצלחת, סומה של נוירון תרכוש צבע ורוד חיוור. הסר את האלקטרודה צבע המכיל על ידי נסיגתו באיטיות מתא העצב.
- השאר הכנות לכ 30 דקות על מנת לאפשר לצבע כדי לפזר לתוך התהליכים העדינים שהופכים את קשר הסינפטי עם הנוירונים חסיד.
4. דימות סידן והקלטת אלקטרו
- הנח את ההכנה על הדמית microscאופ. הצלחת עם ההכנה מתקיימת על פלטפורמת קירור עם חתיכות של כבל האיטום Permagum אשר, בניגוד חימר, נותרת דביק כאשר רטוב. מיקרוסקופ הבמה הקבועה מתמקד ידי הזזה האובייקטיבית. השלב נשאר נייח, המאפשר חיבור המניפולטורים מגנט רכוב. כהגדלה הגבוהה הופכת את התנודות (תנועה לרוחב בעיקר) בעייתית, התקנת ההדמיה כולו צריכה להיות ממוקמת על פלטפורמת בידוד רעידות.
- לשפד את הנוירונים presynaptic וpostsynaptic עם אלקטרודות המכילות תמיסת אלקטרוליט נורמלית.
- בחר בלוק מתאים לתמונת סידן אורנג' מסנן (עירור 549 ננומטר, 576 ננומטר פליטה) 8 ולהתאים את המצלמה. מצלמות CCD המדעיות ביותר את החוקר לבחור תת קבוצה של תאי CCD, כי הם נקראו החוצה. בנוסף, תאים יכולים להיות משולבים (זרק לפח). בחירה קטנה יותר מהירות עליות משנה, תוך רגישות עליות binning. שתי הגדרות אלה, ועם זמן החשיפה, לקבועקצב הפריימים כלומר כמה תמונות ניתן לרכוש בשנייה. הגדרות מתאימות יהיה תמונה על שטח של 350 מיקרומטר 580 x 2 עם 500 x 300 פיקסלים (באמצעות עדשת 10x ומתאם מצלמה 0.5x). הוסף מסנני צפיפות ניטראליות לנתיב האור כדי להתאים את עוצמת התאורה לכמות המינימאלית המספקת חשיפה נכונה בזמן חשיפה <25 אלפיות שני. הגדרות אלה צריכות לגרום לקצב פריימים של 30 רץ - אשר בAplysia מספיק מהיר כדי תמונה האחת ספייק עורר שינויי סידן. לבסוף, לסגור את צמצם השדה כך שרק אזור ההדמיה דולקת.
- בתוכנת ההדמיה לסמן האזורים של נוירון אתה רוצה למדוד. באלמנטי AR התוכנה זה נעשה בסעיף "מדידת הזמן" על ידי צבת אזורים של עניין (Rois). B21 הוא דו קוטבי ונוירון עבודה קודמת הוכיחה כי מגעי התהליך הרוחביים שלה נוירון postsynaptic עניין 9. אנחנו בדרך כלל תמונה ראשונית, שניונית, שליישוני חזייהnches של התהליך הרוחבי על ידי צבת ROI על כל חלק של תא העצב. החזר על השקעה נוספת בסמוך לנוירון המלא הצבע נמדד כדי לספק ערך רקע שנגרע מאוחר יותר מכל נקודתי נתונים האחרות.
- להורות לרכישת electrophysiology (בניסויים אלה ספייק השני) כדי לחכות לאות הדק מסופקת על ידי האות "מסגרת readout" של המצלמה. התחל רכישת התמונה (האלמנטים AR); ספייק השני עכשיו אוטומטית להתחיל להקליט כאשר המצלמה המצלמת הפריים הראשון שלה. ניתן גם להשתמש בפלט TTL של המעצמה 1401 בקצרה כדי להפעיל LED רכוב ביציאת המצלמה של מיקרוסקופ. זה יספק אות לאחר מכן לסנכרן את נתוני הדמיה ואלקטרו.
- לגרות את הנוירון presynaptic ידי הזרקת סדרה של פולסים הנוכחיים depolarizing קצרים בתדירות הרצויה. חשוב לעקוב אחר דופק בכל (למשל עם אוסצילוסקופ גירוי מופעל) כדי לקבוע אם פוטנציאל פעולה הוא successfנוצר ully. בעוד אורנג' סידן הוא מאוד צילום יציב בהשוואה לצבעים אחרים, זה רעיון טוב להקליט משפט שליטה ללא גירוי לבדוק כמה לצבוע הלבנה מתרחשת.
- בניסויים שבם ריכוז יוני הסידן התאי הוא מניפולציה, תרופה כגון EGTA מוחדרת לתא עצב presynaptic ואת פעולות רכישת הגירוי ונתונים שתוארו לעיל חוזרת על עצמם.
5. ניתוח של נתונים יציגים
- לייצא את נתוני ההדמיה (רשימת הערכים שנמדדו בעצמה לכל החזר על השקעה) על ידי כתיבה אותו לקובץ טקסט. תסריט מותאם אישית בספייק השני יכול לאחר מכן לייבא את קובץ הטקסט. סקריפט זה גם מנרמל את הערכים באזור של הבדיקה הפרטנית, ומחסיר את הערך של בדיקת הרקע. נקודתי הנתונים אז הם זממו לצד נתוני electrophysiology כערוץ "וירטואלי RealWave". "תהליך / תפקוד היסט זמן הערוץ" בספייק השני משמש בדיוק ליישר הדמית הנתונים פויNTS, תוך שימוש באות LED כנקודת התייחסות.
- כדי לקבל ערכים כמו שינוי אחוזים, לנתח את נתוני הדמיה על ידי חישוב השינוי היחסי בפלואורסצנטי כDF / F = o (FF o) / F o. F o מציינת את רמת פלואורסצנטי ממש לפני הגירוי וF פלואורסצנטי במהלך הגירוי.
6. נציג תוצאות
איור 1. תכנית כוללת של הניסוי. ניסויים נערך בהכנת גנגליון של Aplysia. שינויים בסידן תוך תאי הם צלמו בצבע זרחני, שהציג iontophoretically לתוך הנוירון סינפטי. הנוירונים מראש וpostsynaptic מכן משופדים עם אלקטרודות חדות כל כך יכולה להיגרם כי העברה הסינפטית ופיקוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדגימים טכניקות שניתן להשתמש בו זמנית לפקח על ריכוז הסידן התוך התאי ולהעריך את היעילות של העברה הסינפטית. שיטות אלה מועילות לקביעה כיצד צורות שונות של פלסטיות לטווח קצר מתווכות.
ההדמיה מבוצעת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת CCD. דרישות ציוד אלה הן צנועות יחסית בהשוואה ללהגדיר קופצים הדמיה פונקציונלית ביותר. הטכניקה היא פשוטה וקלה ללמידה. בעוד הדמיה עם מצלמת CCD מאפשרת הדמיה של שטח גדול עם רזולוציה של זמן טוב, ברזולוציה מרחבית מוגבלת. לכן טכניקה שימושית לבדיקת השערות בנוגע לתפקיד של עליות רקע 'בהיקף נרחבים יחסית או בסידן תוך תאי. כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית ודינמיקת סיד לימוד בקוצים, ליזר סריקת מיקרוסקופ confocal, או מיקרוסקופ 2 פוטון וירוק סיד מחוון הסיד שיכולתילשמש בשינויים קלים בלבד של הפרוטוקול 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
גרנט PHS (MH51393) תמך עבודה זו. חלק מAplysia אנו משתמשים מסופקים על ידי המשאבים הלאומיים לAplysia של אוניברסיטת מיאמי תחת גרנט RR10294 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
|||
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
|||
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
