Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco<em> Aplysia</em
Summary
Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de ganglio<em> Aplysia</em>. Nosotros imagen calcio intracelular usando un colorante fluorescente, naranja calcio, e inducir y controlar la transmisión sináptica con afilados (intracelular) electrodos.
Abstract
Se ha sugerido que los cambios en el calcio intracelular mediar la inducción de un número de importantes formas de plasticidad sináptica (por ejemplo, facilitación, homosináptica) 1. Estas hipótesis pueden ser probadas por monitorizar simultáneamente los cambios en el calcio intracelular y alteraciones en la eficacia sináptica. Se demuestra cómo esto se puede lograr mediante la combinación de imágenes de calcio con técnicas de grabación intracelulares. Nuestros experimentos se llevan a cabo en un ganglio vestibular del molusco Aplysia californica. Esta preparación tiene una serie de características ventajosas experimentalmente: Ganglios puede ser fácilmente eliminado de Aplysia y experimentos utilizar neuronas adultas que hacen conexiones sinápticas normales y tienen una distribución de canales de iones normal. Debido a la baja tasa metabólica del animal y las temperaturas relativamente bajas (14-16 ° C) que son naturales para Aplysia, preparaciones son estables durante largos períodos de tiempo.
ent "> Para detectar cambios en el calcio libre intracelular que utilizaremos la versión celular de calcio impermeant Orange 2, que es fácilmente 'cargado' en una neurona a través de iontoforesis. Cuando este tinte fluorescente de longitud de onda larga se une al calcio, aumenta la intensidad de fluorescencia. calcio Orange tiene propiedades cinéticas rápidas 3 y, a diferencia de los tintes proporcional (por ejemplo, la Fura 2), no requiere rueda de filtros para imágenes. Es bastante estable y menos foto fototóxica que otros colorantes (por ejemplo, fluo-3) 2,4. Al igual que todos los no-radiométrico colorantes, Calcium Orange indica cambios relativos en la concentración de calcio. Pero, debido a que no es posible tener en cuenta los cambios en la concentración de colorante debido a la carga y difusión, no puede ser calibrado para proporcionar concentraciones absolutas de calcio.Una posición vertical, fijo microscopio etapa, el compuesto se utilizó para las neuronas de imagen con una cámara CCD capaz de grabar alrededor de 30 fotogramas por segundo. En Aplysia esta resolución temporales más que suficiente para detectar incluso un único pico de la alteración inducida en la concentración de calcio intracelular. Electrodos afilados se utilizan simultáneamente para inducir y registrar la transmisión sináptica en las neuronas identificadas pre y postsinápticos. Al final de cada ensayo, un script personalizado combina electrofisiología y los datos de imagen. Para asegurar la sincronización adecuada se utiliza un pulso de luz de un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. La manipulación de los niveles de calcio presinápticos (por ejemplo, mediante inyección intracelular EGTA) nos permite poner a prueba hipótesis específicas, en relación con el papel del calcio intracelular en la mediación de las distintas formas de plasticidad.
Protocol
Discussion
Demostramos técnicas que se pueden utilizar para monitorear simultáneamente la concentración de calcio intracelular y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas son útiles para determinar cómo las diversas formas de plasticidad a corto plazo están mediadas.
La formación de imágenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia y cámara CCD. Estos requerimientos de equipo son relativamente modestos en comparación a la mayoría de neuroimagen funcional s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Grant PHS (MH51393) apoya este trabajo. Algunos de los Aplysia que utilizamos son proporcionados por el Nacional de Recursos para Aplysia, de la Universidad de Miami con la subvención RR10294 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
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