Summary
Vi visar hur förändringar i den intracellulära fri kalciumkoncentrationen och synaptisk effektivitet samtidigt kan övervakas på ett ganglion beredning av
Abstract
Det har föreslagits att förändringar i intracellulärt kalcium förmedlar induktion av ett antal viktiga former av synaptisk plasticitet (t.ex. homosynaptic underlättande) 1. Dessa hypoteser kan testas genom samtidig övervakning av förändringar i intracellulärt kalcium och ändringar i synaptisk effekt. Vi visar hur detta kan åstadkommas genom att kombinera kalcium avbildning med intracellulära inspelningstekniker. Våra experiment utförs i en buckal ganglion av blötdjur Aplysia californica. Denna beredning har ett antal experimentellt fördelaktiga egenskaper: Ganglia kan lätt avlägsnas från Aplysia och experiment använder vuxna neuroner som gör normala synaptiska anslutningar och har en normal fördelning jonkanal. På grund av den låga ämnesomsättning av djuret och de relativt låga temperaturer (14-16 ° C) som är naturligt för Aplysia, förberedelser är stabila under långa tidsperioder.
ENT "> För att upptäcka förändringar i intracellulärt fritt kalcium vi kommer att använda cellen ogenomträngligt versionen av kalcium Orange 2 som är lätt" laddad "i ett neuron via jontofores. När denna långa våglängd fluorescerande färg binder till kalcium, fluorescens intensiteten ökar. Kalcium Orange har snabba kinetiska egenskaper 3 och, till skillnad kvotmetriska färgämnen (t.ex. Fura 2), kräver inget filter hjul för avbildning. Det är ganska foto stabil och mindre fototoxisk än andra färgämnen (t.ex. fluo-3) 2,4. Liksom alla icke-ratiometrisk färgämnen, indikerar Kalcium orange relativa förändringar i kalciumkoncentration. Men, eftersom det inte är möjligt att ta hänsyn till förändringar i färgkoncentration på grund av lastning och diffusion, kan det inte kalibreras för att tillhandahålla absoluta kalciumkoncentrationer.En upprättstående, fast fas, sammansatt mikroskop användes för att bilden neuroner med en CCD-kamera kan registrera omkring 30 bilder per sekund. I Aplysia detta tidsupplösningär mer än tillräcklig för att upptäcka även en enda spik inducerad förändring i den intracellulära kalciumkoncentrationen. Skarpa elektroder samtidigt används för att inducera och registrera synaptisk transmission i identifierade pre-och postsynaptiska neuroner. Vid slutet av varje försök, kombinerar en anpassad manus elektrofysiologi och bilddata. För att säkerställa korrekt synkronisering använder vi en ljuspuls från en lysdiod monterad i kamerans port mikroskop. Manipulering av presynaptiska kalciumnivåer (t.ex. genom intracellulär EGTA injektion) ger oss möjlighet att testa specifika hypoteser, om uppgifterna för intracellulärt kalcium i medla olika former av plasticitet.
Protocol
1. Förberedelser
- Söva djuret genom att injicera 75-100 ml isoton lösning magnesiumklorid. Det Aplysia vi använder för avbildning är i allmänhet 150-200 gram och erhålls från Marinus Scientific.
- Nåla fast sövda djur till ett vax täckta skålen. Sprutnålar fungera bra för detta ändamål, sterila tekniker är inte nödvändiga. Använda grova pincett och standard sax gör ett snitt i djurets fot och exponera den buckala massan. Leta reda på buckala ganglion. Med Spring sax och fin pincett försiktigt frigör ganglion genom att skära alla buckala nerver.
- Ta bort ganglion och placera den i en Sylgard belagd maträtt som innehåller artificiella havsvatten. Placera några insekter stift genom de buckala nerverna att stabilisera ganglion. Desheath den buckala ganglion med ultrafina pincett och sax våren, så att exponera nervceller för intracellulär inspelning. Sedan åter fästa ganglion med ca 15 fina insekt (minutien) stift. Det ganglion måste hållas ordentligt på plats som alla rörelse kommer att vara problematiskt under avbildning.
2. Förbered Elektroder
- Dra elektroder med glas kapillärrör med glödtråd (t.ex. WPI TW100F-4) och en avdragare. Inställningar ska bestämmas individuellt för att skapa elektroder önskad motstånd. När de är fyllda med 3 M KAc (kaliumacetat) vår elektrod motstånd är i allmänhet ca 10 MOhms om elektroderna är att vara avfasade, eller omkring 5 MOhms om avfasning utelämnas.
- Fylla en uppsättning av elektroder med en lösning innehållande 3 M KAc/30 mM KCl användning av en spruta och nål microfil. Dessa elektroder kommer att användas för elektrofysiologi.
- Fyll en andra uppsättning elektroder med kalcium indikatorfärgämnet genom att doppa den bakre änden av elektroden i färgämnet, rekonstitueras tidigare med ca. 40 pl destillerat vatten för 500μg färgämne. När spetsen av elektroden har fyllts, tillbaka fylla ca 1/4 tumav änden av elektroden med 200 mM KCl för att säkerställa god elektrisk kontakt.
- Det är fördelaktigt att avfasning elektroderna, eftersom detta underlättar färg injektion och minskar de skador som flera membran genomföringar. Vi använder en anpassad beveler som genererar en ström av ett salt vatten / aluminiumoxidpulver suspension. Elektroden är monterad i en hållare och dess spets in i strömmen vid en 45 ° vinkel. Elektrod motstånd kontinuerligt övervakas och avfasning avslutas när motståndet når ca 5 MOhm för KAC fyllda elektroder. Färgämnet fyllda elektroderna är avfasade för en lika mängd tid och har typiskt resistanser på 15-20 MOhm.
3. Fylla på Dye Kalcium Indikator
- Placera preparatet på ett elektrofysiologi rigg och visuellt lokalisera presynaptiska neuron av intresse. Många av våra experiment görs med en identifierad sensoriska neuron används vid matning, 5 B21, 6. Den relativt fasta positioN, storlek (~ 100 nm), och långsträckt form B21: s soma gör det lätt att hitta.
- Spetsa neuronen av intresse med en elektrod som innehåller färgämnet kalcium indikator. B21 identitet kan verifieras genom spetsa den postsynaptiska neuron B8. Depolarisation av B21 med ~ 8 nA ström kommer att utlösa spikar och resulterar i att underlätta PSP i B8 7.
- Injicera färgämne i det presynaptiska neuronen av intresse genom att hyperpolarisering pulser (typiskt -15 nA, 1 Hz, 75% intermittens) i ca 30 minuter. Om färg belastning är framgångsrik, kommer neuron är somat få en svagt rosa färg. Avlägsna färgämnesinnehållande elektrod genom att långsamt dra den från neuronen.
- Lämna preparat för ungefär 30 minuter för att tillåta färgämnet att diffundera in i de fina processer som gör synaptisk kontakt med följare neuroner.
4. Kalcium Imaging och elektrofysiologiska inspelning
- Placera ut preparatet på bildbehandling Microscopa. Skålen med preparatet hålls på en kylande plattform med bitar av Permagum tätning sladd som till skillnad från lera, förblir klibbig när det är vått. Den fasta steg mikroskop fokuserar genom att flytta målet. Scenen förblir stationär, vilket tillåter att fästa magneten monterade manipulatorer. Som hög förstoring gör vibrationer (särskilt sidorörelse) ett problem, bör hela avbildning installationen placeras på en vibrationsisolering plattform.
- Spetsa presynaptiska och postsynaptiska neuron med elektroder som innehåller normal elektrolytlösning.
- Välj ett filterblock lämplig för bild Kalcium Orange (excitation 549 nm, emission 576 nm) 8 och justera kameran. De flesta vetenskapliga CCD-kameror kan utredaren att välja en delmängd av CCD-celler som läses ut. Dessutom, kan celler kombineras (arkiveras). Välja en mindre delmängd ökar hastigheten, medan binning ökar känsligheten. Dessa två inställningar, tillsammans med exponeringstiden, bestämmabildhastighet dvs hur många bilder som kan förvärvas per sekund. Lämpliga inställningar bild en yta på 580 x 350 um 2 med 500 x 300 pixlar (med hjälp av en 10x lins och en 0,5 x kamera-adapter). Lägg neutrala täthetsfilter till ljusbanan att justera belysningen intensitet till det minimala mängd som ger korrekt exponering med en exponeringstid <25 ms. Dessa inställningar bör resultera i en ram på ca 30 Hz - som i Aplysia är snabb nog för att bilden enda spik framkallat kalcium förändringar. Slutligen stänger fältet öppningen så att endast den bildförsedda området belyses.
- I bildprogram markera neuron regioner som du vill mäta. I Elements AR programmet görs detta i "Time Measurement" sektionen genom att placera områden av intresse (ROI). B21 är en bipolär neuron och tidigare arbete har visat att dess laterala processen kontaktar postsynaptiska neuron av intresse 9. Vi generellt bild primär, sekundär och tertiär behånches av laterala processen genom att placera en ROI över varje del av neuron. En ytterligare ROI bredvid färgämnet fyllda neuronen mäts för att ge en bakgrund värde som senare subtraheras från alla andra datapunkter.
- Instruera elektrofysiologi förvärvet (i dessa experiment Spike II) att vänta på en triggsignal som tillhandahålls av "ram avläsning"-signal av kameran. Starta Image Acquisition (Elements AR), Spike II kommer nu automatiskt starta inspelningen när kameran tar sitt första bildrutan. Du kan även använda en TTL-utgång Power 1401 kortfattat aktivera en lysdiod monterad i mikroskopets kameraporten. Detta kommer att ge en signal till senare synkronisera avbildning och elektrofysiologiska data.
- Stimulera det presynaptiska neuron genom att injicera en serie korta depolariserande strömpulser på önskad frekvens. Det är viktigt att följa upp varje puls (t.ex. med en utlöst stimulans oscilloskop) för att avgöra om en aktionspotential är successfully genereras. Även kalcium Orange är mycket foto-stabil jämfört med andra färgämnen, är det en bra idé att spela en kontroll rättegång utan stimulering för att kontrollera hur mycket färgblekning inträffar.
- I experiment i vilka intracellulära kalciumkoncentrationer är manipulerade, är ett läkemedel såsom EGTA infördes i presynaptiska neuronen och stimulering och datainsamling stegen beskrivna ovan upprepas.
5. Analys av representativa uppgifter
- Exportera bilddata (listan av uppmätta intensitetsvärden för varje ROI) genom att skriva det i en textfil. En anpassad manus i Spike II kan sedan importera textfilen. Detta skript normaliserar även värdena med den enskilde sondens område och subtraherar värdet av bakgrunden sonden. Datapunkterna sedan plottas tillsammans med elektrofysiologi data som en "virtuell RealWave" kanal. Den "kanal process / funktion för tidsförskjutning" i Spike II används för att exakt anpassa avbildning uppgifter points, med hjälp av LED-signalen som referens.
- För att erhålla värden som procent förändring, analysera bilddata genom att beräkna den relativa förändringen i fluorescens som dF / Fo = (FF o) / Fq. Fq betecknar fluorescens nivå strax före stimulus och F fluorescensen under stimulus.
6. Representativa resultat
Figur 1. Systematik av experimentet. Experiment utförs på ett ganglion beredning av Aplysia. Förändringar i intracellulärt kalcium avbildas med ett fluorescerande färgämne, vilket jontoforetiskt införes i presynaptiska neuronen. Pre-och postsynaptiska neuroner därefter spetsas med skarpa elektroder så att synaptisk överföring kan induceras och övervakas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar tekniker som kan användas för att samtidigt övervaka den intracellulära kalciumkoncentrationen och utvärdera effektiviteten av synaptisk transmission. Dessa tekniker är användbara för att bestämma hur olika former av kortfristiga plasticitet förmedlas.
Den avbildning utföres med ett fluorescensmikroskop och CCD-kamera. Dessa krav på utrustning är relativt blygsamma jämfört med de flesta funktionella avbildning-etableringar. Tekniken är enkel och lätt att lära sig. Medan avbildning med en CCD-kamera möjliggör visualisering av ett stort område med bra tidsmässig är spatial upplösning begränsad. Det är därför en användbar teknik för testning hypoteser om den roll som relativt omfattande eller "Bakgrund" ökningar i intracellulärt kalcium. För att förbättra rumsupplösningen och studera dynamik kalcium i ryggrader, en laser-scanning konfokalmikroskop, eller en två foton mikroskop och kalcium indikatorn Kalcium grön jag kundeanvändas med endast smärre modifieringar av protokollet 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
En PHS Grant (MH51393) stött detta arbete. Några av Aplysia vi använder tillhandahålls av nationell resurs för Aplysia vid universitetet i Miami i Grant RR10294 från National Center for Research Resources, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
|||
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
|||
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
