Övervakning av förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen och synaptisk effekt i Blötdjur<em> Aplysia</em
Summary
Vi visar hur förändringar i den intracellulära fri kalciumkoncentrationen och synaptisk effektivitet samtidigt kan övervakas på ett ganglion beredning av<em> Aplysia</em>. Vi bilden intracellulärt kalcium med hjälp av en fluorescerande färg, kalcium apelsin och framkalla och övervaka synaptisk transmission med skarpa (intracellulär) elektroder.
Abstract
Det har föreslagits att förändringar i intracellulärt kalcium förmedlar induktion av ett antal viktiga former av synaptisk plasticitet (t.ex. homosynaptic underlättande) 1. Dessa hypoteser kan testas genom samtidig övervakning av förändringar i intracellulärt kalcium och ändringar i synaptisk effekt. Vi visar hur detta kan åstadkommas genom att kombinera kalcium avbildning med intracellulära inspelningstekniker. Våra experiment utförs i en buckal ganglion av blötdjur Aplysia californica. Denna beredning har ett antal experimentellt fördelaktiga egenskaper: Ganglia kan lätt avlägsnas från Aplysia och experiment använder vuxna neuroner som gör normala synaptiska anslutningar och har en normal fördelning jonkanal. På grund av den låga ämnesomsättning av djuret och de relativt låga temperaturer (14-16 ° C) som är naturligt för Aplysia, förberedelser är stabila under långa tidsperioder.
ENT "> För att upptäcka förändringar i intracellulärt fritt kalcium vi kommer att använda cellen ogenomträngligt versionen av kalcium Orange 2 som är lätt" laddad "i ett neuron via jontofores. När denna långa våglängd fluorescerande färg binder till kalcium, fluorescens intensiteten ökar. Kalcium Orange har snabba kinetiska egenskaper 3 och, till skillnad kvotmetriska färgämnen (t.ex. Fura 2), kräver inget filter hjul för avbildning. Det är ganska foto stabil och mindre fototoxisk än andra färgämnen (t.ex. fluo-3) 2,4. Liksom alla icke-ratiometrisk färgämnen, indikerar Kalcium orange relativa förändringar i kalciumkoncentration. Men, eftersom det inte är möjligt att ta hänsyn till förändringar i färgkoncentration på grund av lastning och diffusion, kan det inte kalibreras för att tillhandahålla absoluta kalciumkoncentrationer.En upprättstående, fast fas, sammansatt mikroskop användes för att bilden neuroner med en CCD-kamera kan registrera omkring 30 bilder per sekund. I Aplysia detta tidsupplösningär mer än tillräcklig för att upptäcka även en enda spik inducerad förändring i den intracellulära kalciumkoncentrationen. Skarpa elektroder samtidigt används för att inducera och registrera synaptisk transmission i identifierade pre-och postsynaptiska neuroner. Vid slutet av varje försök, kombinerar en anpassad manus elektrofysiologi och bilddata. För att säkerställa korrekt synkronisering använder vi en ljuspuls från en lysdiod monterad i kamerans port mikroskop. Manipulering av presynaptiska kalciumnivåer (t.ex. genom intracellulär EGTA injektion) ger oss möjlighet att testa specifika hypoteser, om uppgifterna för intracellulärt kalcium i medla olika former av plasticitet.
Protocol
Discussion
Vi visar tekniker som kan användas för att samtidigt övervaka den intracellulära kalciumkoncentrationen och utvärdera effektiviteten av synaptisk transmission. Dessa tekniker är användbara för att bestämma hur olika former av kortfristiga plasticitet förmedlas.
Den avbildning utföres med ett fluorescensmikroskop och CCD-kamera. Dessa krav på utrustning är relativt blygsamma jämfört med de flesta funktionella avbildning-etableringar. Tekniken är enkel och lätt att lära sig. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
En PHS Grant (MH51393) stött detta arbete. Några av Aplysia vi använder tillhandahålls av nationell resurs för Aplysia vid universitetet i Miami i Grant RR10294 från National Center for Research Resources, NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. . The Handbook. , (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).
