Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em> Aplysia</em
Summary
We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding van<em> Aplysia</em>. We beeld intracellulaire calcium met een fluorescerende kleurstof, Calcium Orange en induceren en synaptische transmissie controle met scherpe (intracellulair) elektroden.
Abstract
Er is gesuggereerd dat veranderingen in intracellulaire calcium de inductie van een aantal belangrijke vormen van synaptische plasticiteit (bijv. homosynaptic vergemakkelijking) 1 bemiddelen. Deze hypothesen worden getest door gelijktijdig monitoren van veranderingen in intracellulaire calcium en veranderingen in synaptische werkzaamheid. We zien hoe dit kan worden bereikt door het combineren calcium beeldvorming met intracellulaire opnametechnieken. Onze experimenten worden uitgevoerd in een buccale ganglion van de weekdieren Aplysia californica. Dit preparaat heeft een aantal voordelige eigenschappen experimenteel: ganglia gemakkelijk uit Aplysia en experimenten volwassen neuronen die normale synaptische verbindingen en een normale verdeling ionkanaal. Vanwege de lage stofwisseling van het dier en de relatief lage temperatuur (14-16 ° C) die natuurlijk voor Aplysia, preparaten stabiel gedurende lange tijd.
ENT "> Om veranderingen in de intracellulaire vrije calcium zullen we de cel impermeant versie van Calcium Orange 2 die gemakkelijk 'geladen' in een neuron via iontoforese gebruiken. detecteren Als dit lange golflengte fluorescente kleurstof bindt aan calcium, fluorescentie-intensiteit toeneemt. Calcium Orange heeft snelle kinetische eigenschappen 3 en, in tegenstelling tot ratiometrisch kleurstoffen (bijv. Fura 2), vereist geen filterwiel voor de beeldvorming. Het is vrij foto stabieler en minder fototoxische dan andere kleurstoffen (bijv. fluo-3) 2,4. Net als alle niet-ratiometrisch kleurstoffen, Calcium Orange relatieve veranderingen in calciumconcentratie aangeeft. Maar, omdat het niet mogelijk is om veranderingen in kleurstofconcentratie door laden en diffusie kan niet worden gekalibreerd absolute calciumconcentraties verschaffen.Een rechte vaste fase samengestelde microscoop werd gebruikt om beeld neuronen met een CCD camera die kan opnemen ongeveer 30 frames per seconde. In Aplysia deze temporele resolutieis meer dan voldoende om zelfs een enkele piek geïnduceerde wijziging detecteren in de intracellulaire calciumconcentratie. Sharp elektroden gelijktijdig gebruikt voor het induceren en synaptische transmissie opnemen in geïdentificeerd pre-en postsynaptische neuronen. Aan het einde van elke test, een aangepast script combineert elektrofysiologie en imaging data. Voor een goede synchronisatie te zorgen dat we gebruik maken van een lichtpuls uit een LED gemonteerd in de camera-poort van de microscoop. Manipulatie van presynaptische calcium (bijv. via intracellulaire EGTA injectie) stelt ons in staat om te testen specifieke hypotheses met betrekking tot de rol van de intracellulaire calciumconcentratie in het bemiddelen verschillende vormen van plasticiteit.
Protocol
Discussion
We tonen technieken die kunnen worden gebruikt om gelijktijdig controleren van de intracellulaire calciumconcentratie en evalueren van de doeltreffendheid van synaptische transmissie. Deze technieken zijn bruikbaar voor het bepalen hoe de verschillende vormen van korte plasticiteit gemedieerd worden.
De beeldvorming wordt uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop en CCD camera. Deze apparatuur eisen zijn relatief bescheiden in vergelijking met de meeste functionele beeldvorming set-ups. De …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een PHS Grant (MH51393) ondersteunt dit werk. Sommige van de Aplysia we gebruiken worden door de National Resource voor Aplysia van de Universiteit van Miami in Grant RR10294 van het National Center for Research Resources, NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. . The Handbook. , (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).
