I cambiamenti di monitoraggio della concentrazione di calcio intracellulare ed efficacia Synaptic nel Mollusco<em> Aplysia</em
Summary
Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio<em> Aplysia</em>. Abbiamo immagine calcio intracellulare utilizzando un colorante fluorescente, Orange calcio, e indurre e controllare la trasmissione sinaptica con taglienti (intracellulare) elettrodi.
Abstract
È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l'induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) 1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l'evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell'animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo.
ent "> Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange 2 che è facilmente 'caricato' in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d'onda lunga si lega al calcio, aumenta l'intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche 3 e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l'imaging. E 'abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) 2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti.Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.
Protocol
Discussion
Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati.
L'immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Una borsa di studio PHS (MH51393) ha sostenuto questo lavoro. Alcuni dei Aplysia usiamo sono fornite dal Risorse Nazionale per l'Aplysia dell'Università di Miami sotto Grant RR10294 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
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