Summary
نبين كيف يمكن تغيير في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الحرة وفعالية متشابك رصد في وقت واحد في إعداد عقدة
Abstract
وقد اقترح أن التغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا توسط في تحريض عدد من الأشكال الهامة من اللدونة متشابك (على سبيل المثال، وتيسير homosynaptic) 1. يمكن اختبار هذه الفرضيات من خلال رصد التغيرات في وقت واحد في الكالسيوم داخل الخلايا وإحداث تغييرات في فعالية متشابك. نحن توضح كيف يمكن تحقيق ذلك من خلال الجمع بين التصوير مع الكالسيوم داخل الخلايا تقنيات التسجيل. وتجرى التجارب لدينا في العقدة الشدق من californica Aplysia الرخويات. هذا المستحضر يحتوي على عدد من الميزات تجريبيا المفيد: يمكن إزالتها بسهولة من العقد والتجارب Aplysia استخدام الخلايا العصبية التي تجعل الكبار اتصالات متشابك العادية ويكون لها قناة ايون العادية التوزيع. نظرا لانخفاض معدل الأيض للحيوان ودرجات حرارة منخفضة نسبيا (14-16 ° C) التي هي طبيعية للAplysia .. يجري مستقرة لفترات طويلة من الزمن.
الأنف والحنجرة "> للكشف عن تغيرات في الخلايا الكالسيوم الحرة سوف نستخدم النسخة المحمولة من impermeant أورانج الكالسيوم (2) الذي هو بسهولة 'تحميل' إلى الخلايا العصبية عن طريق الرحلان الشاردي. هذه الصبغة عندما الطول الموجي الطويل الفلورسنت يربط الكالسيوم، ويزيد من كثافة مضان. أورانج الكالسيوم لديها خصائص الحركية بسرعة 3 و، على عكس الأصباغ ratiometric (على سبيل المثال، FURA 2)، لا يتطلب أي مرشح عجلة للتصوير، وهي الصورة إلى حد ما مستقرة وأقل من الأصباغ سمي ضيائي الأخرى (على سبيل المثال، فلوو-3) 2،4. مثل كل ratiometric غير الأصباغ، البرتقالية الكالسيوم يشير التغيرات النسبية في تركيز الكالسيوم، ولكن لأنه ليس من الممكن لحساب التغيرات في تركيز صبغة بسبب التحميل ونشرها، فإنه لا يمكن معايرتها لتوفير تركيزات الكالسيوم مطلقة.تم استخدام، ثابتة تستقيم المجهر المركب المرحلة، إلى الخلايا العصبية الصورة مع كاميرا CCD قادر على تسجيل نحو 30 لقطة في الثانية. في Aplysia هذا القرار الزمانيهي أكثر من كافية للكشف عن تغيير واحد حتى الناجم عن ارتفاع في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. وتستخدم في وقت واحد أقطاب حادة للحث على نقل وتسجيل متشابك الخلايا العصبية التي تم تحديدها في مرحلة ما قبل وبعد المشبكي. في ختام كل محاكمة، برنامج نصي مخصص يجمع بين الكهربية وتصوير البيانات. لضمان التزامن المناسب نستخدم نبضة ضوء LED من تقام في ميناء الكاميرا من المجهر. التلاعب في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي (على سبيل المثال عن طريق حقن الخلايا EGTA) يسمح لنا لاختبار الفرضيات محددة، فيما يتعلق بدور الكالسيوم داخل الخلايا في التوسط أشكال مختلفة من اللدونة.
Protocol
1. إعداد
- تخدير عن طريق حقن الحيوان 75-100 مل كلوريد المغنيسيوم متساوي التوتر حل. وAplysia نستخدمها للتصوير عموما 150-200 غرام ويتم الحصول عليها من العلم مارينوس.
- دبوس تخدير الحيوان إلى طبق الشمع مغطاة. حقنة الإبر تعمل بشكل جيد لهذا الغرض؛ التقنيات العقيمة ليست ضرورية. باستخدام ملقط ومقص الإجمالي القياسية إجراء شق في القدم الحيوان وفضح الشامل الشدق. تحديد موقع العقدة الشدق. باستخدام مقص وملقط الربيع الجميلة، مجانا بعناية العقدة عن طريق قطع جميع الأعصاب الشدق.
- إزالة العقدة ووضعها في طبق يحتوي على مياه البحر Sylgard المغلفة الاصطناعي. وضع دبابيس الحشرات قليلة من خلال الأعصاب الشدق لتحقيق الاستقرار في العقدة. Desheath العقدة باستخدام ملقط الشدق متناهية الصغر ومقص الربيع، وذلك لكشف الخلايا العصبية بين الخلايا للتسجيل. ثم إعادة دبوس العقدة باستخدام الحشرات حوالي 15 دقيقة (دقائقutien) الدبابيس. يجب أن تعقد عقدة راسخة في مكانها لأن أي حركة سوف يكون مشكلة أثناء التصوير.
2. إعداد أقطاب
- سحب أسلاك باستخدام أنابيب الزجاج الشعرية مع خيوط (مثل WPI TW100F-4) ومجتذب أ. وينبغي تحديد الإعدادات بشكل فردي لخلق أقطاب المقاومة المطلوبة. عندما مليئة شركة الخطوط الجوية الكويتية M 3 (خلات البوتاسيوم) مقاومتنا الكهربائي بشكل عام حوالي 10 MOhms إذا الأقطاب هي أن مشطوف، أو حوالي 5 MOhms إذا تم حذف خطوة تجليف.
- ملء مجموعة واحدة من الأقطاب الكهربائية مع محلول يحتوي على 3 M ملي بوكل KAc/30 باستخدام المحاقن والإبر microfil. وسوف تستخدم هذه الأقطاب الكهربية ل.
- ملء مجموعة ثانية من الأقطاب الكهربائية مع الكالسيوم صبغ المؤشر عن طريق غمس نهاية الخلفي من القطب في صبغ، أعادت سابقا مع تقريبا. 40 ميكرولتر الماء المقطر لصبغ 500μg. عندما غيض من القطب قد ملأت، وملء عودة حوالي 1/4 بوصةمن نهاية القطب مع 200 ملي بوكل لضمان الاتصال الكهربائية جيدة.
- فإنه من المفيد أن شطبة الأقطاب، وهذا يسهل حقن صبغة ويقلل من الضرر الناجم عن الاختراقات غشاء متعددة. نستخدم beveler المخصصة التي تولد تيار من مسحوق التعليق المياه المالحة / الألومينا. هي التي شنت القطب في حامل وطرفها يدخل تيار بزاوية ° 45. ويتم رصد مستمر ومقاومة القطب إنهاء تجليف عندما تصل المقاومة على Mohm حوالي 5 لشركة الخطوط الجوية الكويتية أقطاب شغلها. ومشطوف الأقطاب صبغ شغلها عن مبلغ مساو من الوقت وعادة ما يكون من المقاومات على Mohm 15-20.
3. تحميل صبغ المؤشر الكالسيوم
- وضع على منصة إعداد الكهربية وتحديد بصريا الخلايا العصبية قبل المشبكي في المصالح. تتم العديد من تجاربنا مع الخلايا العصبية الحسية لتحديد استخدام أثناء الرضاعة، B21 5، 6. وpositio ثابتة نسبيان، وحجم (~ 100 ميكرون)، وشكل مطول من سوما B21 تجعل من السهل العثور على.
- خوزق الخلايا العصبية في المصالح مع إلكترود تحتوي على صبغة مؤشر الكالسيوم. يمكن التحقق من الهوية عن طريق B21 التخوزق ما بعد متشابك الخلايا العصبية B8. وإزالة الاستقطاب من B21 مع نا الحالي ~ 8 تؤدي المسامير ونتيجة في تسهيل بسبس في B8 7.
- حقن صبغة في الخلايا العصبية قبل المشبكي من الفائدة عن طريق تمرير النبضات hyperpolarizing (عادة -15 نا، 1 هرتز و 75٪ لدورة العمل) لحوالي 30 دقيقة. إذا صبغ التحميل بنجاح، سوف سوما الخلايا العصبية في الحصول على اللون الوردي خافت. إزالة القطب الصبغة المحتوية بسحب ببطء من الخلايا العصبية.
- ترك الاستعدادات لحوالي 30 دقيقة للسماح للصبغة لنشر في عمليات الاتصال التي تجعل غرامة متشابك مع الخلايا العصبية تابعا.
4. التصوير الكالسيوم وتسجيل الكهربية
- وضع على إعداد microsc التصويرمكتب مستشار رئيس الوزراء. يقام الطبق مع إعداد على منصة تبريد قطعة من الحبل مع الختم Permagum التي، على عكس الطين، لا يزال لزجة عندما تكون رطبة. المجهر المرحلة الثابتة من خلال نقل ويركز الهدف. المرحلة لا تزال ثابتة، والذي يسمح إرفاق المتلاعبين المغناطيس المحملة. كما تضخم عالية يجعل الاهتزازات (الحركة الجانبية خاصة) مشكلة، يجب وضع الإعداد التصوير بالكامل على منصة الاهتزاز العزلة.
- خوزق الخلايا العصبية قبل المشبكي وبعد المشبكي مع الأقطاب الكهربائية العادية التي تحتوي على حل بالكهرباء.
- تحديد كتلة مناسبة لتصفية الصورة الكالسيوم أورانج (549 نانومتر الإثارة، 576 نانومتر الانبعاثات) 8 وضبط الكاميرا. معظم الكاميرات CCD العلمية تسمح المحقق لاختيار مجموعة فرعية من الخلايا CCD التي يتم قراءتها خارج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الخلايا (اهمال). اختيار أصغر سرعة الزيادات فرعية، في حين يزيد الحساسية binning. هذه الإعدادات اثنين، جنبا إلى جنب مع زمن التعرض، وتحديدمعدل الإطار أي عدد الصور يمكن الحصول عليها في الثانية الواحدة. سوف الإعدادات المناسبة صورة مساحة من 580 ميكرون 350 × 500 بكسل 2 مع 300 × (باستخدام عدسة 10x ومحول كاميرا 0.5x). إضافة عوامل تصفية الكثافة محايدة لمسار الضوء لضبط شدة الإضاءة إلى الحد الأدنى الذي يوفر التعرض الصحيح مع زمن التعرض <25 مللي. هذه الإعدادات يجب أن يؤدي إلى معدل الإطار من حوالي 30 هرتز - الذي هو في Aplysia بسرعة كافية لصورة واحدة أثار ارتفاع الكالسيوم التعديلات. وأخيرا، أغلق فتحة المجال بحيث يضيء فقط المنطقة المصورة.
- في برامج التصوير بمناسبة الخلايا العصبية في المناطق التي تريد قياسها. في البرنامج AR عناصر يتم ذلك في قسم "وقت القياس" من خلال وضع مناطق الاهتمام (رويس). B21 هو العصبون ثنائي القطب والأعمال السابقة قد أثبتت أن عملية اتصالاتها الجانبية بعد المشبكي الخلايا العصبية التي تهم 9. ونحن عموما الصورة الأولية، البرازيلي الثانوي، والتعليم العاليnches عملية الجانبية من خلال وضع ROI على كل جزء من الخلايا العصبية. يتم قياس عائد استثمار إضافي بجانب الخلايا العصبية صبغ شغلها لتوفير قيمة الخلفية التي يتم طرح في وقت لاحق من جميع نقاط البيانات الأخرى.
- تعليمات اكتساب الكهربية (سبايك في هذه التجارب II) لانتظار إشارة الزناد المقدمة من إشارة "قراءات الإطار" للكاميرا. بدء الحصول على الصور (AR عناصر)؛ سبايك II سوف تبدأ تلقائيا الآن تسجيل عندما تلتقط الكاميرا الإطار الأول. يمكنك أيضا استخدام الناتج TTL من السلطة لفترة وجيزة من 1401 إلى تحويل على LED التي تقام في ميناء الكاميرا المجهر ل. وهذا سيوفر إشارة لمزامنة البيانات في وقت لاحق والتصوير الكهربية.
- تحفيز الخلايا العصبية قبل المشبكي عن طريق حقن سلسلة من نبضات قصيرة الحالي في إزالة إستقطاب التردد المطلوب. من المهم رصد كل نبضة (على سبيل المثال مع الذبذبات الناجمة التحفيز) لتحديد ما إذا كان العمل هو إمكانية successfولدت ully. بينما أورانج الكالسيوم جدا الصور مستقرة مقارنة مع الأصباغ الأخرى، انها فكرة جيدة لتسجيل محاكمة السيطرة دون التحفيز للتحقق من مدى صبغ التبييض يحدث.
- في التجارب التي يتم التلاعب تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا، يتم إدخال المخدرات مثل EGTA في الخلايا العصبية قبل المشبكي ويتم تكرار الخطوات اقتناء التحفيز والبيانات المذكورة أعلاه.
5. تحليل البيانات الممثل
- تصدير البيانات التصوير (قائمة القيم المقاسة لكل شدة ROI) من خلال كتابة ذلك في ملف نصي. ويمكن لبرنامج نصي مخصص في الثاني سبايك ثم استيراد ملف نصي. هذا السيناريو أيضا تطبيع مع القيم منطقة التحقيق الفرد، وينقص من قيمة التحقيق الخلفية. ثم يتم رسم نقاط البيانات جنبا إلى جنب مع البيانات الكهربية باعتبارها "افتراضية RealWave" قناة. يتم استخدام "قناة عملية / الوقت وظيفة التحول" في الثاني سبايك لمحاذاة بالضبط بيانات التصوير البوياليلة، وذلك باستخدام إشارة LED كمرجع.
- للحصول على القيم والتغيير في المئة، وتحليل البيانات عن طريق حساب التصوير التغير النسبي في مضان ومدافع / O = F (FF س) / س F. F O يدل على مستوى مضان قبيل التحفيز وF مضان خلال التحفيز.
6. ممثل النتائج
الشكل 1. الخطة الشاملة للتجربة. وتجرى التجارب في إعداد العقدة من Aplysia. وتصوير التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا مع صبغة الفلورسنت، والتي يتم تقديمها إلى الخلايا العصبية iontophoretically قبل المشبكي. ومخوزق ثم الخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي مع أقطاب الحاد يمكن أن يتسبب ذلك أن انتقال متشابك ورصدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
علينا أن نبرهن التقنيات التي يمكن استخدامها في وقت واحد لمراقبة تركيز الكالسيوم داخل الخلايا وتقييم فعالية انتقال متشابك. هذه التقنيات مفيدة لتحديد كيفية توسط أشكال مختلفة من قصيرة الأجل اللدونة.
ويتم التصوير بها مع مضان المجهر والكاميرا CCD. هذه الاحتياجات من المعدات متواضعة نسبيا بالمقارنة مع مجموعة عمليات التصوير أكثر وظيفية. هذه التقنية بسيطة وسهلة للتعلم. بينما التصوير مع كاميرا CCD تسمح برؤية مساحة واسعة لقرار الزمنية جيدة، ويقتصر القرار المكانية. ولذلك تقنية مفيدة لاختبار الفرضيات المتعلقة بدور واسع النطاق نسبيا أو زيادات 'خلفية' في الكالسيوم داخل الخلايا. لتحسين القرار المكانية وديناميات الكالسيوم في العمود الفقري الدراسة، ليزر متحد البؤر المسح الضوئي المجهر، أو المجهر الفوتون اثنين والكالسيوم الكالسيوم المؤشر الأخضر أستطعيتم استخدامها مع تعديلات طفيفة فقط من البروتوكول 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد PHS غرانت (MH51393) هذا العمل. وتقدم بعض Aplysia نستخدمها من قبل الموارد الوطنية للAplysia من جامعة ميامي في إطار المنحة RR10294 من المركز الوطني للبحوث الموارد، NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
|||
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
|||
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
