מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em> Aplysia</em
Summary
אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של גנגליון<em> Aplysia</em>. אנחנו תמונת הסידן תוך תאי באמצעות צבע פלואורסצנטי, אורנג' סידן, ולעורר ולפקח על העברה הסינפטית עם אלקטרודות חדות (תאי).
Abstract
היה מי שהציע כי שינויים בסידן תאי לתווך אינדוקציה של מספר הצורות חשובות של פלסטיות הסינפטית (הנחיית למשל, homosynaptic) 1. השערות אלה ניתן לבדוק על ידי ניטור שינויים בסידן תוך תאי ושינויים ביעילות הסינפטית בו זמנית. אנו מדגימים כיצד זה יכול להתבצע על ידי שילוב הדמית סידן עם טכניקות הקלטה תאיות. הניסויים שלנו מתנהלים בגנגליון buccal של Aplysia californica הרכיכה. הכנה זו כוללת מספר התכונות מועילות בניסוי: גרעינים ניתן להסיר בקלות מAplysia וניסויים להשתמש תאי עצב בוגרים המרכיבים קשרים סינפטיים רגילים ויש לי ערוץ הפצת יון רגילה. בשל שיעור הנמוך מטבולים של בעלי החיים והטמפרטורות הנמוכות יחסית (14-16 מעלות צלזיוס) שהנם טבעיים לAplysia, הכנות הן יציבות לפרקי זמן ארוכים.
> אף אוזן גרון "כדי לזהות שינויים בסידן חופשי תאי אנו משתמשים בגרסת impermeant התא של סידן אורנג' 2 אשר בקלות" נטען "לנוירון באמצעות iontophoresis. כאשר צבע אורך גל ניאון ארוך זה נקשר לסידן, עולה עוצמת קרינה. הסיד אורנג' יש תכונות מהירות הקינטית 3 ו, בניגוד לצבעי ratiometric (למשל, Fura 2), לא דורשות גלגל מסנן עבור הדמיה. זה די תמונה יציבה ופחות phototoxic מצבעים אחרים (למשל, Fluo-3) 2,4. כמו כל הלא ratiometric צבעים, סידן אורנג' מציין שינויים יחסיים בריכוז הסידן. אבל, מכיוון שלא ניתן להסביר את השינויים בריכוז צבע עקב טעינה ודיפוזיה, זה לא יכול להיות מכויל לספק ריכוז יוני הסידן מוחלט.במה, מיקרוסקופ זקוף, קבוע מתחם שמש לנוירונים תמונה עם מצלמה מסוגלת להקליט סביב 30 מסגרות לשנייה CCD. בAplysia הרזולוציה של הזמן הזההוא יותר ממספק כדי לזהות אפילו שינוי מושרה ספייק יחיד בריכוז הסידן התוך התאי. אלקטרודות שארפ משמשות בו זמנית כדי לגרום ולהקליט שידור סינפטי בנוירונים לפני וpostsynaptic מזוהים. בסיומו של כל משפט, תסריט מותאם אישית משלב נתוני ההדמיה electrophysiology ו. כדי להבטיח סינכרון ראוי אנו משתמשים דופק אור LED הרכוב בנמל המצלמה של המיקרוסקופ. מניפולציה של רמות הסידן presynaptic (למשל, באמצעות הזרקת EGTA תאית) מאפשרת לנו לבחון את השערות ספציפיות, הנוגע לתפקידו של הסידן תוך תאי בתיווך צורות שונות של פלסטיות.
Protocol
Discussion
אנו מדגימים טכניקות שניתן להשתמש בו זמנית לפקח על ריכוז הסידן התוך התאי ולהעריך את היעילות של העברה הסינפטית. שיטות אלה מועילות לקביעה כיצד צורות שונות של פלסטיות לטווח קצר מתווכות.
ההדמיה מבוצעת עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומצלמת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
גרנט PHS (MH51393) תמך עבודה זו. חלק מAplysia אנו משתמשים מסופקים על ידי המשאבים הלאומיים לAplysia של אוניברסיטת מיאמי תחת גרנט RR10294 מהמרכז הלאומי למשאבי מחקר, NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h., Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h., Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. . The Handbook. , (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , (2005).
