Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l'efficacité synaptique dans le mollusque<em> Aplysie</em
Summary
Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l'efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de ganglion<em> Aplysie</em>. Nous l'image de calcium intracellulaire à l'aide d'un colorant fluorescent, orange calcium, et d'induire et de contrôler la transmission synaptique avec tranchants (intracellulaire) électrodes.
Abstract
Il a été suggéré que les changements dans le calcium intracellulaire médiation de l'induction d'un certain nombre d'importantes formes de plasticité synaptique (par exemple, la facilitation homosynaptique) 1. Ces hypothèses peuvent être testées en même temps surveiller les changements dans le calcium intracellulaire et des changements dans l'efficacité synaptique. Nous démontrons comment cela peut être réalisé en combinant l'imagerie calcique avec les techniques d'enregistrement intracellulaire. Nos expériences sont menées dans un ganglion vestibulaire du mollusque Aplysia californica. Cette préparation a un certain nombre de caractéristiques avantageuses expérimentalement: Ganglia peut être facilement retiré de l'aplysie et expériences utilisent neurones adultes qui font de connexions synaptiques normales et ont une distribution normale d'ions canal. En raison de la faible taux métabolique de l'animal et les températures relativement basses (14-16 ° C) qui sont naturels pour l'aplysie, les préparations sont stables pendant de longues périodes de temps.
Calcium ent "> Pour détecter les changements dans le calcium intracellulaire libre, nous allons utiliser la version portable imperméant de calcium Orange 2 qui est facilement« chargé »dans un neurone par ionophorèse. Lorsque cette teinture fluorescente grande longueur d'onde se lie au calcium, augmentation de l'intensité de fluorescence. Orange a propriétés cinétiques rapides 3 et, contrairement aux colorants ratiométriques (par exemple, le Fura 2), ne nécessite pas de roue de filtres pour l'imagerie. Il est assez photo stable et moins phototoxique que d'autres colorants (par exemple, fluo-3) 2,4. Comme tous les non-ratiométrique colorants, de calcium Orange indique les changements relatifs à la concentration de calcium. Mais, car il n'est pas possible de tenir compte des changements dans la concentration de colorant dues au chargement et à la diffusion, elle ne peut pas être calibré pour fournir les concentrations de calcium absolus.Une verticale, microscope fixe composé stade, a été utilisé pour les neurones d'image avec une caméra CCD permet d'enregistrer environ 30 images par seconde. Chez l'aplysie cette résolution temporelleest plus que suffisant pour détecter même un seul pic induit par la modification de la concentration de calcium intracellulaire. Électrodes pointues sont utilisées simultanément pour induire et d'enregistrer la transmission synaptique dans les neurones identifiés pré-et post-synaptiques. À la fin de chaque essai, un script personnalisé combine électrophysiologie et des données d'imagerie. D'assurer une bonne synchronisation on utilise une impulsion de lumière provenant d'une diode montée dans l'orifice de caméra du microscope. La manipulation des niveaux calciques présynaptiques (par exemple via l'EGTA injection intracellulaire) nous permet de tester des hypothèses spécifiques, concernant le rôle du calcium intracellulaire dans la médiation de diverses formes de plasticité.
Protocol
Discussion
Nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller simultanément la concentration de calcium intracellulaire et d'évaluer l'efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques sont utiles pour déterminer comment les différentes formes de plasticité à court terme sont médiatisés.
La formation d'image est effectuée avec un microscope à fluorescence et une caméra CCD. Ces besoins en équipement sont relativement modestes par rapport à la plupa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un PHS Grant (MH51393) ont soutenu ce travail. Une partie de l'aplysie, nous utilisons sont fournis par le national de ressources pour l'aplysie de l'Université de Miami dans le cadre de la Subvention RR10294 Centre national de recherche sur les ressources, le NIH.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalogue Number | Comment |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M0250 | used in 0.33 M solution to anesthetize animal |
Table 1. Reagents used.
| Equipment Name | Company | Comment |
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | |
| NIS elements AR (version 3.22) |
Nikon Instruments | imaging software used to acquire fluorescence data |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging |
| LS-DWL halogen lamp |
Sumica | |
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | |
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz |
| Spike II (version 7.07) |
Cambridge Electronic Design | software used to acquire electrophysiology data |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate |
Table 2. Equipment used.
References
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