Summary
Si dimostra come cambiamenti nella concentrazione di calcio libero intracellulare ed efficacia sinaptica possono monitorare in un preparato di ganglio
Abstract
È stato suggerito che le variazioni di calcio intracellulare mediano l'induzione di un certo numero di importanti forme di plasticità sinaptica (ad esempio, facilitazione homosynaptic) 1. Queste ipotesi possono essere testati contemporaneamente seguire l'evoluzione del calcio intracellulare e alterazioni in termini di efficacia sinaptica. Si dimostra come questo può essere realizzato combinando calcium imaging con tecniche di registrazione intracellulari. I nostri esperimenti sono condotti in un ganglio vestibolare del mollusco Aplysia californica. Questa preparazione ha una serie di caratteristiche vantaggiose sperimentalmente: Ganglia può essere facilmente rimosso dal Aplysia ed esperimenti utilizzare neuroni adulti che rendono normali connessioni sinaptiche e hanno una distribuzione normale canale ionico. A causa del basso tasso metabolico dell'animale e le temperature relativamente basse (14-16 ° C) che sono naturali per Aplysia, preparati sono stabili per lunghi periodi di tempo.
ent "> Per rilevare le variazioni di calcio libero intracellulare useremo la versione impermeant cella di calcio Orange 2 che è facilmente 'caricato' in un neurone tramite ionoforesi. Quando questo colorante fluorescente lunghezza d'onda lunga si lega al calcio, aumenta l'intensità di fluorescenza. calcio Orange ha veloci proprietà cinetiche 3 e, a differenza di coloranti raziometrici (ad esempio, Fura 2), non necessita di ruota portafiltri per l'imaging. E 'abbastanza stabile e meno foto fototossiche di altri coloranti (ad esempio, fluo-3) 2,4. Come tutti i non-raziometrico coloranti, calcio Arancione indica variazioni relative di concentrazione di calcio. Ma, poiché non è possibile tener conto delle variazioni concentrazione di colorante dovute al carico e diffusione, non può essere calibrato per fornire concentrazioni di calcio assoluti.Un montante, fisso stadio, microscopio composto è stato usato per i neuroni di immagine con una fotocamera CCD in grado di registrare circa 30 fotogrammi al secondo. In questo Aplysia risoluzione temporaleè più che sufficiente per rilevare anche un singolo picco alterazione indotta nella concentrazione di calcio intracellulare. Elettrodi Sharp sono contemporaneamente utilizzati per indurre e registrare la trasmissione sinaptica in neuroni identificati pre-e post-sinaptico. Al termine di ogni prova, uno script personalizzato combina elettrofisiologia e dati di imaging. Per garantire la corretta sincronizzazione usiamo un impulso di luce da un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. La manipolazione dei livelli di calcio presinaptici (ad esempio tramite iniezione intracellulare EGTA) ci permette di testare ipotesi specifiche, riguardanti il ruolo del calcio intracellulare nel mediare le varie forme di plasticità.
Protocol
1. Preparazione
- Anestetizzare l'animale mediante iniezione di 75-100 ml di soluzione isotonica di cloruro di magnesio. L'Aplysia che usiamo per l'imaging sono in genere 150-200 grammi e sono ottenuti da Marinus scientifico.
- Pin anestetizzato l'animale a un piatto coperto di cera. Aghi per siringhe funzionano bene per questo scopo; tecniche sterili non sono necessari. Utilizzo di pinze e forbici lordi standard, fare un'incisione nel piede dell'animale ed esporre la massa buccale. Individuare il ganglio vestibolare. Utilizzo di forbici e pinze a molla raffinati, cura gratuitamente il ganglio, tagliando tutti i nervi vestibolari.
- Rimuovere il ganglio e metterlo in un piatto rivestito Sylgard contenente acqua di mare artificiale. Mettere un paio di perni di insetti attraverso i nervi buccale per stabilizzare il ganglio. Desheath il ganglio vestibolare con pinze e forbici ultrafini primavera, in modo da esporre i neuroni per la registrazione intracellulare. Poi ri-pin del ganglio con circa 15 insetti fine (minutien) pin. Il ganglio deve essere tenuta saldamente in posizione come qualsiasi movimento sarà problematica durante l'esposizione.
2. Preparare Elettrodi
- Tirare elettrodi con tubo capillare di vetro con filamento (ad esempio WPI TW100F-4) e di un estrattore. Le impostazioni dovrebbero essere determinato individualmente per creare elettrodi della necessaria resistenza. Quando riempito con 3 M Kac (acetato di potassio), la nostra resistenza elettrodo è generalmente di circa 10 MOhm se gli elettrodi devono essere smussati, o circa 5 MOhm se la fase di smussatura viene omesso.
- Riempire una serie di elettrodi con una soluzione contenente 3 M KCl KAc/30 mM con una siringa e l'ago Microfil. Questi elettrodi saranno utilizzati per elettrofisiologia.
- Riempire una seconda serie di elettrodi con il colorante indicatore calcio immergendo l'estremità posteriore dell'elettrodo in tintura, precedentemente ricostituito con ca. 40 microlitri di acqua distillata per tintura 500μg. Quando la punta dell'elettrodo è riempito, riempimento posteriore circa 1/4 pollicedella estremità dell'elettrodo con 200 mM KCl per assicurare un buon contatto elettrico.
- È vantaggioso per smussare gli elettrodi, ciò facilita l'iniezione colorante e riduce il danno di membrana penetrazioni multiple. Usiamo un beveler personalizzato che genera un flusso di una sospensione di acqua salata / allumina polvere. L'elettrodo è montato su un supporto e la sua punta entra nel flusso con un angolo di 45 °. Resistenza dell'elettrodo viene continuamente monitorata e la smussatura terminato quando la resistenza raggiunge circa 5 MOhm per gli elettrodi KAC pieni. Gli elettrodi colorante piene sono smussati per un uguale periodo di tempo e in genere hanno resistenze di MOhm 15-20.
3. Caricamento del colorante indicatore di calcio
- Mettere il preparato su una piattaforma elettrofisiologia e individuare visivamente il neurone presinaptico di interesse. Molti dei nostri esperimenti sono fatti con un neurone identificato sensoriale utilizzata durante l'alimentazione, B21 5, 6. La Positio relativamente fisson, dimensioni (~ 100 micron), e la forma allungata del soma B21 lo rendono facile da individuare.
- Impalare il neurone di interesse con un elettrodo contenente il colorante indicatore di calcio. B21 identità può essere verificata impalandoli postsinaptica neurone B8. Depolarizzazione di B21 con ~ 8 corrente nA attiverà punte e risultati nel facilitare PSP in B8 7.
- Iniettare colorante nel neurone presinaptico di interesse passando impulsi iperpolarizzante (tipicamente -15 nA, 1 Hz, duty cycle del 75%) per circa 30 minuti. Se il caricamento colorante è successo, soma del neurone acquisirà un colore rosa tenue. Rimuovere il colorante contenente elettrodo lentamente ritirando dal neurone.
- Lascia i preparativi per circa 30 minuti per permettere al colorante di diffondersi nei processi sottili che fanno contatto sinaptico con i neuroni follower.
4. Calcio Imaging e registrazione elettrofisiologica
- Mettere il preparato sul microsc immaginiOpe. Il piatto con la preparazione si svolge su un tavolo di raffreddamento con pezzi di filo sigillante Permagum che, a differenza di argilla, rimane appiccicosa quando è bagnato. Il microscopio palcoscenico fisso concentra spostando l'obiettivo. Lo stadio resta fermo, che permette di collegare manipolatori magnete montato. Come l'ingrandimento elevato rende le vibrazioni (in particolare il movimento laterale) un problema, il programma di installazione di imaging intero deve essere posto su una piattaforma di isolamento dalle vibrazioni.
- Impale neuroni presinaptici e postsinaptici con elettrodi contenenti normale soluzione elettrolitica.
- Selezionare un blocco filtro adatto al calcio Arancione immagine (eccitazione 549 nm, emissione 576 nm) 8 e regolare la telecamera. La maggior parte scientifici telecamere CCD permettono al ricercatore di scegliere un sottoinsieme di cellule CCD che vengono lette. Inoltre, le cellule possono essere combinati (categorizzate). Selezionando un piccolo sottoinsieme velocità aumenta, mentre aumenta la sensibilità binning. Queste due impostazioni, insieme con il tempo di esposizione, determinanoil frame rate cioè quante immagini possono essere acquisite al secondo. Impostazioni adatte volontà immagine su una superficie di 580 x 350 micron 2 con 500 x 300 pixel (con una lente 10x e un adattatore per fotocamera 0.5x). Aggiungere filtri a densità neutra al percorso di luce per regolare l'intensità di illuminazione per la quantità minima che fornisce esposizione corretta con un tempo di esposizione <25 ms. Queste impostazioni dovrebbe portare a un frame rate di circa 30 Hz - che in Aplysia è abbastanza veloce per singola immagine evocata picco alterazioni di calcio. Infine, chiudere il diaframma di campo in modo che solo l'area imaged è illuminato.
- Nel software di imaging segnare regioni del neurone che si desidera misurare. Nella AR Elements questo viene fatto in "Tempo di misura" sezione mettendo regioni di interesse (ROI). B21 è un neurone bipolare e lavoro precedente ha dimostrato che i suoi contatti processo laterale del neurone postsinaptico di interesse 9. In genere l'immagine primaria, reggiseno secondaria e terziarianches del processo laterale mettendo una ROI su ogni parte del neurone. Un ulteriore ROI vicino al neurone colorante riempito viene misurata per fornire un valore di sfondo che viene successivamente sottratto da tutti gli altri punti dati.
- Istruire l'acquisizione elettrofisiologia (in questi esperimenti Spike II) attendere un segnale di trigger fornito dal "lettura frame" del segnale della telecamera. Avviare l'acquisizione delle immagini (elementi AR); Spike II ora avviare automaticamente la registrazione quando la fotocamera prende il primo fotogramma. È inoltre possibile utilizzare una uscita TTL del Potere 1401 a passare brevemente in un LED montato nella porta fotocamera del microscopio. Ciò fornirà un segnale per sincronizzare successivamente imaging e dati elettrofisiologici.
- Stimolare il neurone presinaptico iniettando una serie di brevi impulsi depolarizzanti corrente alla frequenza desiderata. È importante monitorare ogni impulso (ad esempio con un oscilloscopio stimolo attivato) per determinare se un potenziale di azione è successfully generato. Mentre Arancione calcio è molto foto-stabile rispetto ad altri coloranti, è una buona idea registrare un processo di controllo senza stimolazione per controllare la quantità di colorante sbiancamento si verifica.
- In esperimenti in cui vengono manipolate concentrazioni di calcio intracellulare, un farmaco come EGTA viene introdotto nel neurone presinaptico e le fasi di acquisizione e stimolazione dati sopra descritte vengono ripetute.
5. Analisi dei dati rappresentativi
- Esportare i dati di imaging (l'elenco dei valori di intensità misurati per ogni ROI) scrivendo in un file di testo. Uno script personalizzato in Spike II quindi possibile importare il file di testo. Questo script normalizza anche i valori della sonda con zona dell'individuo, e sottrae il valore della sonda sfondo. I punti dati vengono poi tracciate a fianco i dati di elettrofisiologia come "virtuale RealWave" canale. Il "canale di processo / funzione Time Shift" di Spike II viene utilizzato per allineare con precisione l'imaging dati pointi, utilizzando il led di segnalazione come riferimento.
- Per ottenere valori come variazione percentuale, analizzare i dati di imaging calcolando la variazione relativa di fluorescenza come dF / F o = (FF o) / F o. F o denota il livello di fluorescenza appena prima dello stimolo e F la fluorescenza durante lo stimolo.
6. Risultati rappresentativi
Figura 1. Schema generale della sperimentazione. Gli esperimenti sono condotti in un preparato ganglio di Aplysia. Variazioni di calcio intracellulare sono ripreso con un colorante fluorescente, che è iontophoretically introdotto nel neurone presinaptico. Neuroni pre-e post-sinaptico sono poi impalato con elettrodi appuntiti in modo che la trasmissione sinaptica può essere indotto e controllato.
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Discussion
Dimostriamo tecniche che possono essere utilizzati per monitorare simultaneamente la concentrazione intracellulare di calcio e di valutare l'efficacia della trasmissione sinaptica. Queste tecniche sono utili per determinare in che modo le varie forme di plasticità a breve termine sono mediati.
L'immagine viene eseguita con un microscopio a fluorescenza e camera CCD. Questi requisiti apparecchiature sono relativamente modesta se confrontata con la maggior parte di imaging funzionale set-up. La tecnica è semplice e facile da imparare. Mentre imaging con una telecamera CCD permette la visualizzazione di una grande area con buona risoluzione temporale, risoluzione spaziale è limitata. E 'quindi una tecnica utile per verifica delle ipotesi sul ruolo del relativamente diffuse o' background 'aumento del calcio intracellulare. Per migliorare la risoluzione spaziale e la dinamica di calcio di studio in spine, un laser-microscopio confocale, microscopio o due fotoni e l'indicatore verde di calcio di calcio che ho potutoessere utilizzato con solo lievi modifiche del protocollo 10.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Una borsa di studio PHS (MH51393) ha sostenuto questo lavoro. Alcuni dei Aplysia usiamo sono fornite dal Risorse Nazionale per l'Aplysia dell'Università di Miami sotto Grant RR10294 dal Centro nazionale per le risorse di ricerca, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
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| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
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References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
