Summary
Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de ganglio
Abstract
Se ha sugerido que los cambios en el calcio intracelular mediar la inducción de un número de importantes formas de plasticidad sináptica (por ejemplo, facilitación, homosináptica) 1. Estas hipótesis pueden ser probadas por monitorizar simultáneamente los cambios en el calcio intracelular y alteraciones en la eficacia sináptica. Se demuestra cómo esto se puede lograr mediante la combinación de imágenes de calcio con técnicas de grabación intracelulares. Nuestros experimentos se llevan a cabo en un ganglio vestibular del molusco Aplysia californica. Esta preparación tiene una serie de características ventajosas experimentalmente: Ganglios puede ser fácilmente eliminado de Aplysia y experimentos utilizar neuronas adultas que hacen conexiones sinápticas normales y tienen una distribución de canales de iones normal. Debido a la baja tasa metabólica del animal y las temperaturas relativamente bajas (14-16 ° C) que son naturales para Aplysia, preparaciones son estables durante largos períodos de tiempo.
ent "> Para detectar cambios en el calcio libre intracelular que utilizaremos la versión celular de calcio impermeant Orange 2, que es fácilmente 'cargado' en una neurona a través de iontoforesis. Cuando este tinte fluorescente de longitud de onda larga se une al calcio, aumenta la intensidad de fluorescencia. calcio Orange tiene propiedades cinéticas rápidas 3 y, a diferencia de los tintes proporcional (por ejemplo, la Fura 2), no requiere rueda de filtros para imágenes. Es bastante estable y menos foto fototóxica que otros colorantes (por ejemplo, fluo-3) 2,4. Al igual que todos los no-radiométrico colorantes, Calcium Orange indica cambios relativos en la concentración de calcio. Pero, debido a que no es posible tener en cuenta los cambios en la concentración de colorante debido a la carga y difusión, no puede ser calibrado para proporcionar concentraciones absolutas de calcio.Una posición vertical, fijo microscopio etapa, el compuesto se utilizó para las neuronas de imagen con una cámara CCD capaz de grabar alrededor de 30 fotogramas por segundo. En Aplysia esta resolución temporales más que suficiente para detectar incluso un único pico de la alteración inducida en la concentración de calcio intracelular. Electrodos afilados se utilizan simultáneamente para inducir y registrar la transmisión sináptica en las neuronas identificadas pre y postsinápticos. Al final de cada ensayo, un script personalizado combina electrofisiología y los datos de imagen. Para asegurar la sincronización adecuada se utiliza un pulso de luz de un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. La manipulación de los niveles de calcio presinápticos (por ejemplo, mediante inyección intracelular EGTA) nos permite poner a prueba hipótesis específicas, en relación con el papel del calcio intracelular en la mediación de las distintas formas de plasticidad.
Protocol
1. Preparación
- Se anestesia el animal mediante la inyección de 75-100 ml de solución isotónica de cloruro de magnesio. El Aplysia que utilizamos para formación de imágenes son generalmente 150-200 gramos y se obtienen a partir Marinus Scientific.
- Pin el animal anestesiado a un plato cubierto de cera. Agujas de jeringa funcionan bien para este propósito; técnicas estériles no son necesarios. Con unas pinzas y tijeras brutos estándar hacen una incisión en la pata del animal y exponer la masa bucal. Localice el ganglio vestibular. Con unas tijeras y pinzas de resorte fino, cuidadosamente gratis el ganglio cortando todos los nervios vestibulares.
- Retire el ganglio y colóquelo en un plato Sylgard recubierto que contiene agua de mar artificial. Coloque unas pocas pins del insecto a través de los nervios vestibulares para estabilizar el ganglio. Desheath el ganglio vestibular usando fórceps y tijeras ultrafinas de resorte, a fin de exponer las neuronas para el registro intracelular. Después, vuelva a fijar el ganglio utilizando aproximadamente 15 insectos fino (minutien pins). El ganglio debe mantenerse firme en su lugar ya que cualquier movimiento será problemático durante la exploración.
2. Preparar Electrodos
- Tire electrodos utilizando tubería capilar de vidrio con filamento (por ejemplo WPI TW100F-4) y un extractor. Esta configuración debe ser determinado individualmente para crear electrodos de la resistencia requerida. Cuando se llena con 3 M KAc (acetato de potasio) nuestra resistencia del electrodo es generalmente de aproximadamente 10 MOhms si los electrodos están a achaflanar, o aproximadamente 5 MOhms si el paso de biselado se omite.
- Llenar un conjunto de electrodos con una solución que contiene 3 M KCl KAc/30 mM utilizando una jeringa y aguja microfil. Estos electrodos se utilizan para electrofisiología.
- Llenar un segundo conjunto de electrodos con el colorante indicador de calcio mediante la inmersión del extremo posterior del electrodo en tinte, previamente reconstituidos con aprox. 40 l de agua destilada para tinte 500μg. Cuando la punta del electrodo se ha llenado, de nuevo llenar aproximadamente 1/4 pulgadasdel extremo del electrodo con 200 mM KCl para asegurar un buen contacto eléctrico.
- Es beneficioso para biselar los electrodos, ya que esto facilita la inyección de tinte y reduce el daño causado por las penetraciones de membrana múltiples. Usamos un biselador habitual que genera una corriente de una suspensión de sal en polvo agua / alúmina. El electrodo se monta en un soporte y su punta penetra en la corriente en un ángulo de 45 °. La resistencia del electrodo se controla continuamente y se termina el biselado cuando la resistencia alcanza aproximadamente 5 MOhm para electrodos KAC llenos. Los electrodos de tinte llenas están biselados para una cantidad igual de tiempo y típicamente tienen resistencias de MOhm 15-20.
3. Carga del tinte indicador de calcio
- Colocar la preparación en una plataforma de electrofisiología y localizar visualmente la neurona presináptica de interés. Muchos de nuestros experimentos se hacen con una neurona sensorial identificado utilizado durante la alimentación, B21 5, 6. La positio relativamente fijon, el tamaño (~ 100 m), y la forma alargada del soma B21 hacen que sea fácil de localizar.
- Empalar la neurona de interés con un electrodo que contiene el colorante indicador de calcio. Identidad B21 puede ser verificada por empalar el post-sináptica de neuronas B8. La despolarización de B21 con ~ 8 nA actual dará lugar a picos y el resultado en la facilitación de PSPs en B8 7.
- Inyectar material de contraste en la neurona presináptica de interés al pasar impulsos de hiperpolarización (típicamente -15 nA, 1 Hz, 75% del ciclo de trabajo) durante aproximadamente 30 minutos. Si la carga de colorante tiene éxito, el soma de la neurona adquiere un color rosa pálido. Retire el electrodo que contiene el colorante lentamente se retiraba de la neurona.
- Deja preparativos para aproximadamente 30 minutos para permitir que el tinte se difunda en los procesos finos que hacen contacto sináptico con las neuronas del seguidor.
4. El calcio de imágenes y grabación electrofisiológica
- Colocar la preparación en la imagen microscope. El plato de la preparación se lleva a cabo en una plataforma de refrigeración con trozos de cable sellado Permagum que, a diferencia de arcilla, sigue siendo pegajoso cuando está húmedo. El microscopio de platina fija centra moviendo el objetivo. La etapa permanece estacionario, lo que permite fijar manipuladores imán montado. Como la gran amplificación hace vibraciones (movimiento lateral especialmente) un problema, la configuración de imagen completa debe ser colocado en una plataforma de aislamiento de vibraciones.
- Empalar neuronas presinápticas y postsinápticas con electrodos que contienen solución electrolítica normal.
- Seleccione un bloque de filtro adecuado para Calcio imagen Orange (excitación 549 nm, emisión 576 nm) 8 y ajustar la cámara. La mayoría de las cámaras CCD científicos permite al investigador elegir un subconjunto de celdas CCD que se leen. Además, las células se pueden combinar (agrupaciones). Selección de un subconjunto más pequeño aumenta la velocidad, mientras que hurgar en la basura aumenta la sensibilidad. Estas dos configuraciones, junto con el tiempo de exposición, determinarla velocidad de fotogramas es decir, cuántas imágenes se pueden adquirir por segundo. Ajustes adecuados tomará imágenes de un área de 580 x 350 m 2 con 500 x 300 píxeles (usando un lente de 10x y un adaptador de cámara 0.5x). Añadir filtros de densidad neutra para la trayectoria de la luz para ajustar la intensidad de la iluminación a la cantidad mínima que proporciona una exposición correcta con un tiempo de exposición <25 ms. Estos ajustes deben resultar en una velocidad de alrededor de 30 Hz - que en Aplysia es lo suficientemente rápido para una sola imagen pico evocados alteraciones de calcio. Finalmente, cierre la abertura campo de manera que sólo el área de la imagen se ilumina.
- En el software de imágenes de marcar regiones de las neuronas que desea medir. En el software de Elementos AR esto se hace en la "Medición de la hora" mediante la colocación de regiones de interés (ROIs). B21 es una neurona bipolar y el trabajo previo ha demostrado que sus contactos proceso lateral de la neurona postsináptica de interés 9. Por lo general, la imagen principal sostén, secundaria y terciarianches del proceso lateral mediante la colocación de una ROI en cada parte de la neurona. Un ROI adicional junto a la neurona colorante llena se mide para proporcionar un valor de fondo que es posteriormente restado de todos los demás puntos de datos.
- Instruir a la adquisición de electrofisiología (en estos experimentos II Spike) para esperar una señal de activación proporcionada por la "lectura marco" de la señal de la cámara. Inicie la adquisición de la imagen (Elementos AR); Espiga II ahora se inicia automáticamente la grabación cuando la cámara realiza su primer cuadro. También puede utilizar una salida TTL del Poder 1401 a referirme brevemente a un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. Esto proporcionará una señal para sincronizar posteriormente formación de imágenes y datos electrofisiológicos.
- Estimular la neurona presináptica mediante la inyección de una serie de breves pulsos de corriente de despolarización a la frecuencia deseada. Es importante controlar cada pulso (por ejemplo, con un osciloscopio de estímulo desencadena) para determinar si un potencial de acción es successfUlly generado. Mientras que Orange calcio es muy foto-estable en comparación con otros tintes, es una buena idea grabar un ensayo de control sin estimulación para comprobar la cantidad de tinte blanqueamiento ocurre.
- En experimentos en los que las concentraciones de calcio intracelular son manipuladas, un fármaco tal como EGTA se introduce en la neurona presináptica y los pasos de adquisición de estimulación y datos descritos anteriormente se repiten.
5. Análisis de los datos representativos
- Exportar los datos de imágenes (la lista de valores de intensidad medidos para cada ROI) al escribir en un archivo de texto. Un script personalizado de Spike II continuación, puede importar el archivo de texto. Este script también normaliza los valores con zona de la sonda individuo, y resta el valor de la sonda de fondo. Los puntos de datos se representan a continuación junto con los datos de electrofisiología como un "virtual RealWave" canal. El "canal de proceso / función de cambio de hora" de Spike II se utiliza para alinear con precisión los datos de imágenes points, utilizando la señal de LED como referencia.
- Para obtener los valores como porcentaje de cambio, analizar los datos de imagen mediante el cálculo de la variación relativa de la fluorescencia como dF / F o = (FF o) / o F. F O denota el nivel de fluorescencia justo antes del estímulo y F la fluorescencia durante el estímulo.
6. Los resultados representativos
Figura 1. Esquema general del experimento. Los experimentos se llevan a cabo en una preparación de ganglio de Aplysia. Los cambios en el calcio intracelular se crean imágenes con un colorante fluorescente, que se iontoforéticamente introducido en la neurona presináptica. Neuronas pre y postsinápticos son entonces empalado con electrodos afilados de modo que la transmisión sináptica puede inducirse y monitoreados.
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Discussion
Demostramos técnicas que se pueden utilizar para monitorear simultáneamente la concentración de calcio intracelular y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas son útiles para determinar cómo las diversas formas de plasticidad a corto plazo están mediadas.
La formación de imágenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia y cámara CCD. Estos requerimientos de equipo son relativamente modestos en comparación a la mayoría de neuroimagen funcional set-ups. La técnica es simple y fácil de aprender. Mientras imágenes con una cámara CCD permite la visualización de un área grande con buena resolución temporal, la resolución espacial está limitada. Por tanto, es una técnica útil para probar hipótesis sobre el papel de relativamente generalizados o 'background' el aumento de calcio intracelular. Para mejorar la resolución espacial y la dinámica de estudio del calcio en las espinas, un láser de barrido microscopio confocal, o un microscopio de dos fotones y el verde indicador de calcio El calcio que pudierautilizarse con sólo pequeñas modificaciones del protocolo 10.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
A Grant PHS (MH51393) apoya este trabajo. Algunos de los Aplysia que utilizamos son proporcionados por el Nacional de Recursos para Aplysia, de la Universidad de Miami con la subvención RR10294 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
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| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
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References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
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