Summary
We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding van
Abstract
Er is gesuggereerd dat veranderingen in intracellulaire calcium de inductie van een aantal belangrijke vormen van synaptische plasticiteit (bijv. homosynaptic vergemakkelijking) 1 bemiddelen. Deze hypothesen worden getest door gelijktijdig monitoren van veranderingen in intracellulaire calcium en veranderingen in synaptische werkzaamheid. We zien hoe dit kan worden bereikt door het combineren calcium beeldvorming met intracellulaire opnametechnieken. Onze experimenten worden uitgevoerd in een buccale ganglion van de weekdieren Aplysia californica. Dit preparaat heeft een aantal voordelige eigenschappen experimenteel: ganglia gemakkelijk uit Aplysia en experimenten volwassen neuronen die normale synaptische verbindingen en een normale verdeling ionkanaal. Vanwege de lage stofwisseling van het dier en de relatief lage temperatuur (14-16 ° C) die natuurlijk voor Aplysia, preparaten stabiel gedurende lange tijd.
ENT "> Om veranderingen in de intracellulaire vrije calcium zullen we de cel impermeant versie van Calcium Orange 2 die gemakkelijk 'geladen' in een neuron via iontoforese gebruiken. detecteren Als dit lange golflengte fluorescente kleurstof bindt aan calcium, fluorescentie-intensiteit toeneemt. Calcium Orange heeft snelle kinetische eigenschappen 3 en, in tegenstelling tot ratiometrisch kleurstoffen (bijv. Fura 2), vereist geen filterwiel voor de beeldvorming. Het is vrij foto stabieler en minder fototoxische dan andere kleurstoffen (bijv. fluo-3) 2,4. Net als alle niet-ratiometrisch kleurstoffen, Calcium Orange relatieve veranderingen in calciumconcentratie aangeeft. Maar, omdat het niet mogelijk is om veranderingen in kleurstofconcentratie door laden en diffusie kan niet worden gekalibreerd absolute calciumconcentraties verschaffen.Een rechte vaste fase samengestelde microscoop werd gebruikt om beeld neuronen met een CCD camera die kan opnemen ongeveer 30 frames per seconde. In Aplysia deze temporele resolutieis meer dan voldoende om zelfs een enkele piek geïnduceerde wijziging detecteren in de intracellulaire calciumconcentratie. Sharp elektroden gelijktijdig gebruikt voor het induceren en synaptische transmissie opnemen in geïdentificeerd pre-en postsynaptische neuronen. Aan het einde van elke test, een aangepast script combineert elektrofysiologie en imaging data. Voor een goede synchronisatie te zorgen dat we gebruik maken van een lichtpuls uit een LED gemonteerd in de camera-poort van de microscoop. Manipulatie van presynaptische calcium (bijv. via intracellulaire EGTA injectie) stelt ons in staat om te testen specifieke hypotheses met betrekking tot de rol van de intracellulaire calciumconcentratie in het bemiddelen verschillende vormen van plasticiteit.
Protocol
1. Voorbereiding
- Verdoven van het dier door injectie 75-100 ml isotone magnesiumchlorideoplossing. De Aplysia we gebruiken voor de beeldvorming over het algemeen 150-200 gram en worden verkregen uit Marinus Scientific.
- Speld de verdoofde dier naar een wax dekschaal. Injectienaalden werken goed voor dit doel; steriele technieken zijn niet nodig. Met behulp van de bruto pincet en standaard schaar maakt een sneetje in de voet van het dier en bloot de buccale massa. Zoek de buccale ganglion. Met behulp van de lente schaar en fijne tang, zorgvuldig gratis het ganglion door het snijden van alle buccale zenuwen.
- Verwijder het ganglion en plaats deze in een Sylgard gecoate schaal met kunstmatig zeewater. Plaats een paar insecten pinnen via de buccale zenuwen naar het ganglion stabiliseren. Desheath de buccale ganglion met ultrafijne forceps en veer schaar, zodat de neuronen voor intracellulaire opname bloot. Dan opnieuw pin het ganglion met behulp van ongeveer 15 fijne insect (minutien) pinnen. De ganglion moet stevig worden vastgehouden als elke beweging problematisch tijdens de beeldvorming.
2. Bereid Elektroden
- Trek elektroden met behulp van glazen capillaire buis met gloeidraad (bijv. WPI TW100F-4) en een trekker. De instellingen moeten individueel worden bepaald aan de elektroden van de vereiste weerstand te creëren. Gevuld met 3 M KAC (kaliumacetaat) onze elektrode weerstand is gewoonlijk ongeveer 10 MOhms als de elektroden worden afgeschuind, of ongeveer 5 MOhms als de afschuining wordt weggelaten.
- Vul een set elektrodes met een oplossing die 3 M KAc/30 mM KCl met een spuit en naald microfilter. Deze elektroden worden gebruikt voor elektrofysiologie.
- Vul een tweede stelsel van elektroden met de calcium indicator kleurstof door dompelen de achterkant van de elektrode in kleurstof, eerder opgelost in ca. 40 pi gedestilleerd water voor 500 Ilg kleurstof. Wanneer de punt van de elektrode gevuld opnieuw vullen ongeveer 1/4 inchhet einde van de elektrode met 200 mM KCl om een goed elektrisch contact te waarborgen.
- Het is gunstig voor bevel de elektroden, dit bevordert kleurstof injectie en vermindert de schade door meerdere membraan doorvoeren. We maken gebruik van een aangepaste Beveler dat een stroom van een zout water / aluminiumoxidepoeder ophanging genereert. De elektrode is gemonteerd in een houder en de punt komt de stroom bij een hoek van 45 °. Elektrode weerstand wordt continu bewaakt en de afschuining beëindigd wanneer de weerstand bereikt ongeveer 5 MOhm voor Kac gevulde elektroden. De kleurstof gevulde elektroden zijn afgeschuind voor een gelijke hoeveelheid tijd en typisch weerstanden van 15-20 MOhm.
3. Het laden van de Calcium Indicator Dye
- Plaats de voorbereiding op een elektrofysiologie rig en visueel zoek de presynaptische neuron van belang. Veel van onze experimenten worden uitgevoerd met een identificeerbare sensorisch neuron gebruikt bij de toevoer, B21 5, 6. De relatief vaste position, grootte (~ 100 urn), en langwerpige vorm van de soma B21's maken het gemakkelijk te vinden.
- Spietsen het neuron van belang met een elektrode die de calcium indicator kleurstof. B21 de identiteit kan worden geverifieerd door gespietst de post-synaptische neuron B8. Depolarisatie van B21 met ~ 8 nA stroom zal leiden tot pieken en resultaat in het faciliteren van PSP's in B8 7.
- Injecteer kleurstof in de presynaptische neuron van belang door het passeren van hyperpolariserende pulsen (typisch -15 nA, 1 Hz, 75% inschakelduur) gedurende ongeveer 30 minuten. Als kleurstof laden succesvol is, zal het neuron de soma het verwerven van een vage roze kleur. Verwijder de kleurstof bevattende elektrode langzaam trekken uit het neuron.
- Laat de voorbereidingen voor ongeveer 30 minuten om de kleurstof te diffunderen in de fijne processen die synaptische contact te maken met aanhanger neuronen.
4. Calcium Imaging en Elektrofysiologische opnemen
- Plaats de voorbereiding op de beeldvorming MicroscOpe. De schaal met de opstelling wordt vastgehouden op een platform koelen met stukjes Permagum afdichtkoord die, in tegenstelling tot klei, kleverig blijft nat. De vaste fase microscoop zich door verplaatsen van het objectief. Het podium blijft stilstaan, waardoor het bevestigen magneet gemonteerd manipulators. Omdat de hoge vergroting maakt trillingen (vooral zijwaartse beweging) een probleem, moet de gehele imaging setup worden geplaatst op een trillingsisolatie platform.
- Spietsen presynaptische en postsynaptische neuronen met elektroden met normale elektrolyt oplossing.
- Selecteer een filter blok geschikt is om beeld Calcium Oranje (excitatie 549 nm, emissie 576 nm) 8 en stel de camera. De meeste wetenschappelijke CCD camera's kan de onderzoeker een subset van CCD cellen die uitgelezen kiezen. Daarnaast kunnen cellen worden gecombineerd (weggegooid). Selecteren van een kleinere subset verhoogt de snelheid, terwijl binning verhoogt de gevoeligheid. Deze twee instellingen samen met de belichtingstijd bepalende frame rate te weten hoeveel beelden kunnen worden verworven per seconde. Geschikte instellingen zal beeld een gebied van 580 x 350 pm 2 met 500 x 300 pixels (met behulp van een 10x lens en een 0,5 x camera adapter). Voeg grijsfilters het lichtpad de lichtintensiteit aanpassen aan de minimale hoeveelheid die correcte belichting met een belichtingstijd <25 ms geeft. Deze instellingen moet resulteren in een frame rate van ongeveer 30 Hz - die in Aplysia is snel genoeg om de afbeelding enkele spike opgeroepen calcium veranderingen. Tenslotte sluit de opening veld zodat alleen het afgebeelde wordt verlicht.
- In de imaging software markeer de neuron regio's die u wilt meten. In de Elements AR software wordt dit gedaan in de "Time Measurement" sectie door het plaatsen van de regio's van belang (ROI). B21 is een bipolaire neuron en eerder werk heeft aangetoond dat de laterale proces contact op met de postsynaptische neuron van belang 9. Wij over het algemeen beeld primaire, secundaire en tertiaire behanches van de laterale proces door een ROI over ieder deel van het neuron. Een extra ROI naast de kleurstof gevulde neuron gemeten wordt met een achtergrond die verderop wordt afgetrokken van alle andere data punten geven.
- Instrueren de elektrofysiologie acquisitie (in deze experimenten Spike II) te wachten op een triggersignaal door de "frame aflezing" signaal van de camera. Start de beeldacquisitie (Elements AR); Spike II zal nu automatisch beginnen met opnemen wanneer de camera neemt de eerste frame. U kunt ook gebruik maken van een TTL-uitgang van de Power 1401 tot kort ingaan op een LED gemonteerd in de camera van de microscoop-poort. Dit zal een signaal vervolgens synchroniseren imaging en elektrofysiologische data.
- Stimuleren presynaptische neuron door injectie van een reeks korte depolariseren stroompulsen op de gewenste frequentie. Het is belangrijk om elke puls te volgen (bijv. met een stimulus getriggerd oscilloscoop) om te bepalen of een actiepotentiaal is successfUlly gegenereerd. Terwijl Calcium Orange is zeer foto-stabiel in vergelijking met andere kleurstoffen, is het een goed idee om een controle proces opnemen zonder stimulatie om te controleren hoeveel verven bleken optreedt.
- In experimenten waarbij intracellulaire calciumconcentraties gemanipuleerd wordt een geneesmiddel zoals EGTA ingebracht in het presynaptische neuron en de stimulatie en data acquisitie hierboven beschreven stappen worden herhaald.
5. Analyse van de representatieve gegevens
- Exporteer de beeldgegevens (de lijst van de gemeten intensiteit waarden voor elk ROI) door het schrijven van het in een tekstbestand. Een aangepast script in Spike II kan vervolgens importeren het tekstbestand. Dit script normaliseert ook de waarden van de individuele oppervlakte sonde en trekt de waarde van de achtergrond probe. De gegevenspunten worden vervolgens uitgezet langs de elektrofysiologie gegevens als een "virtuele RealWave" kanaal. Het "channel proces / time shift functie" in Spike II wordt gebruikt om precies uitlijnen van de beeldgegevens poigen, met behulp van de LED-signaal als referentie.
- Waarden als percentage verandering te verkrijgen, de beeldgegevens te analyseren door de relatieve verandering in fluorescentie als dF / o = F (FF o) / F o. O F geeft het fluorescentieniveau net voor de stimulus en F de fluorescentie gedurende de stimulus.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Algemeen schema van het experiment. Experimenten worden uitgevoerd in een ganglion voorbereiding van Aplysia. Veranderingen in intracellulaire calcium worden afgebeeld met een fluorescerende kleurstof die iontoforetisch wordt in de presynaptische neuron. Pre-en postsynaptische neuronen worden dan gespietst met scherpe elektroden, zodat synaptische transmissie kan worden geïnduceerd en bewaakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We tonen technieken die kunnen worden gebruikt om gelijktijdig controleren van de intracellulaire calciumconcentratie en evalueren van de doeltreffendheid van synaptische transmissie. Deze technieken zijn bruikbaar voor het bepalen hoe de verschillende vormen van korte plasticiteit gemedieerd worden.
De beeldvorming wordt uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop en CCD camera. Deze apparatuur eisen zijn relatief bescheiden in vergelijking met de meeste functionele beeldvorming set-ups. De techniek is eenvoudig en makkelijk te leren. Terwijl beeldvorming met een CCD-camera maakt visualisatie van een groot gebied met een goede temporele resolutie, is ruimtelijke resolutie beperkt. Daarom is een nuttige techniek voor het testen hypothesen betreffende de rol van relatief brede of 'achtergrond' toename in intracellulair calcium. Ruimtelijke resolutie en studie calciumdynamiek in stekels verbeteren, een laser-scanning confocale microscoop of twee foton microscoop en calcium indicator Calcium Green I kanworden met slechts geringe modificaties van het protocol 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Een PHS Grant (MH51393) ondersteunt dit werk. Sommige van de Aplysia we gebruiken worden door de National Resource voor Aplysia van de Universiteit van Miami in Grant RR10294 van het National Center for Research Resources, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
|||
| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
|||
References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
