Summary
Fluorescens vid total internreflexion (TIRF) mikroskopi är en kraftfull metod för att observera strukturer nära cellens yta vid hög kontrast och temporal upplösning. Vi visa hur TIRF kan användas för att studera protein-dynamiken vid cortex av cellväggen slutna bakterie-och svampceller.
Abstract
TIRF mikroskopi har blivit en kraftfull bildteknik för att studera spatio-temporala dynamiken i fluorescerande molekyler i in vitro och i levande celler 1. Det optiska fenomenet av total intern reflektion inträffar när ljus passerar från ett medium med högt brytningsindex i ett medium med lågt brytningsindex vid en vinkel större än en karakteristisk kritisk vinkel (dvs närmare att vara parallell med gränsen). Även om allt ljus reflekteras tillbaka under sådana förhållanden, är en försvinnande våg skapas som utbreder sig över och längs gränsen, som sönderfaller exponentiellt med avståndet, och endast tränger prov områden som är 100-200 nm nära gränssnittet 2. Förutom att tillhandahålla överlägsna axiell upplösning, ger den minskade excitering av oskarpa fluoroforer ett mycket högt signal-till-brusförhållanden och minimerar skadliga effekterna av fotoblekning 2,3. Att vara en widefield teknik gör TIRF också snabbare bilden ACFörvärvet än de flesta skanning baserade konfokala inställningar.
Vid första anblicken verkar låg penetration djup TIRF är oförenligt med avbildning av bakterie-och svamp celler, som ofta omges av tjocka cellväggar. Tvärtom, har vi funnit att cellväggarna av jäst och bakterieceller faktiskt förbättrar användbarheten av TIRF och öka utbudet av observerbara strukturer 4-8. Många cellulära processer kan därför direkt åtkomst till TIRF i små, encelliga mikroorganismer, som ofta erbjuder kraftfulla genetiska manipulation tekniker. Detta tillåter oss att genomföra in vivo biokemi experiment, där kinetiken av protein interaktioner och aktiviteter direkt kan bedömas i levande celler.
Vi beskriver här de olika steg som krävs för att få bilder med hög kvalitet TIRF för Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi påpeka olika problem som kan Affect TIRF visualisering av fluorescerande prober i celler och illustrera proceduren med flera applikationsexempel. Slutligen visar vi hur TIRF bilder ytterligare kan förbättras med hjälp av etablerade tekniker bild restaurering.
Protocol
1. Provberedning
- Förbereda täckglas
Täckglas bör rengöras från damm partiklar som TIRF är känslig för bakgrunden signaler som härrör från täckglaset (Fig. 1A, Film 1).- Använd pincett glider plats omslag i ett keramiskt hållare med lock.
- Fylla glasbehållare med 1 M NaOH (kan återanvändas flera gånger).
- Inkubera under 2 h under långsam kontinuerlig rotation (orbital shaker). Överdriven inkubering (> 8 timmar) kommer att skapa opaka täckglas.
- Tvätta två gånger med destillerat vatten i 5 min under långsam kontinuerlig rotation.
- Förvaras i keramik hållare behandlas i 100% etanol.
- Framställning Bacillus subtilis-celler
- Späd till en OD 600 på 0,01 - 0,05 i 5 ml av lämpliga tillväxtmedier och växa till exponentiell fas (OD 600 av 0,3-0,7).
- Framställ 1,25% agaros i vatten eller ett medium. Använda syntetiska media för att reducera bakgrundsfluorescens. Upplösa pulvret i en 1,5 ml plaströr vid 95 ° C och förvara i värmeblock vid 72 ° C.
- Tillsätt en liten droppe av agaros till mitten av en bild och trycker in en plan dyna med en andra bild. Noggrant separata bilder efter minst 2 min eller före användning.
- Spinn ner 500 il celler i mikro-centrifug vid 12,000 rpm i 1 min.
- Kassera supernatant, och återsuspendera pelleten i 50 | il medium.
- Tillsätt 2-4 il celler till centrum av agarosen dynan.
- Ta en rengjord täckremsa från den fyllda etanol behållaren med pincett, torr med tryckluft och försiktigt lägga på prov.
- Låt celler nöja minst 2 min före mikroskopi.
- Täta kanterna täckglaset med VALAP (vaselin, lanolin och paraffin, blandas med lika vikt under värme, tillämpas med liten borste eller spottatUla) för långsiktig avbildning.
- Framställning Saccharomyces cerevisiae-celler
- Späd före-kultur och växa i lämpliga media för minst 5 h till exponentiell fas (OD 600 0,2 till 0,8).
- Ta en täckremsa från behållaren med pincett och torra med trycksatt luft.
- Sprida 5 pl Concanavalin A-lösning (ConA, 2 | ig / ml i destillerat vatten) på täckglas med en pipett och torr med tryckluft. ConA binder till kolhydrater av jästcellväggen och immobiliserar jästceller.
- Överföra 4,5 pl suspension jästcell till en sida av ConA-belagda täckglas. Placera försiktigt täckglas på objektglas. Starta med en kant och låter falla långsamt för att undvika bildning av luftbubblor.
- Låt celler nöja minst 2 min före mikroskopi.
- Seal kanterna täckglaset med VALAP (se ovan) för långsiktig avbildning.
- Mikroskop konfiguration
Vi utförde alla experiment på en anpassad TIRF inställning bygger på en helt automatiserad iMic stativ (Till Photonics) med en Olympus 100x 1,45 NA mål. 75 MW DPSS lasrar vid 488 nm (sammanhängande safir) och 561 nm (Kobolt Jive) användes som ljuskällor. Lasrar valdes genom en AOTF och leds via en bredbandsanslutning fiber till iMic. En galvanometer-driven två-axeln skannerhuvudet användes för att justera infallsvinklar eller fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) position. En ytterligare galvanometer användes för att växla mellan epifluorescens, FRAP och TIRF. Bilder samlades med en Andor iXON DU-897 EMCCD kamera och en 2x förstoringslins framför kameran. Förvärvet kontrolleras av Live Acquisition (Till Photonics) programpaketet.
Följande punkter bör beaktas:- Programmerbar kontroll över belysningskällan (laser lINE) och TIRF vinkel är avgörande för reproducerbara resultat och särskilt för flera färger TIRF, där infallsvinkeln måste justeras för varje excitation våglängd för att säkerställa lika penetration av flyktiga vågor. I vår inställning TIRF kan justeras omedelbart via två galvanometrar som direkt styrs från Live Acquisition programpaketet.
- Vår anpassad installation tillåter dessutom snabb växling mellan epifluorescens, TIRF och FRAP via en tredje galvanometer, vilket ger en enkel mätning av lokalisering kinetik för objekt spåras i TIRF.
- Mål-typ TIRF kräver höga bländare NA> 1,4. Vi använde en Olympus 100x NA 1,45 mål.
- EMMCD kameror fungerar mycket bra med TIRF grund av deras höga signal-brusförhållande. För att möjliggöra avbildning med optimal känslighet använde vi en 512x512 pixel back belyses EMCCD kamera med en pixelstorlek på 16 nm. För att bibehålla maximal upplösning har vi placerat en 2x MAGNification lins framför kameran.
- Som TIRF är en widefield teknik, intensitet laserstrålar sprids ut. Starka lasrar därför ofta bättre bilder. Vi använde 75 mW diodpumpade solid state (DPSS) lasrar vid 488 nm och 561 nm.
- För att hålla celler under optimala tillväxtbetingelser under avbildning, använda lämpliga miljökontroll. Vi använde en specialtillverkad värmekammare (Fig. 1B) för att studera jäst temperaturkänsliga mutanter. För medelstora Stockholmsbörsen under förvärvet har vi använt antingen enkla flöde kammare eller glasbottnade rätter kultur som lätt kan nås från ovan på den inverterade mikroskopet.
- Justera parametrar
- Identifiera ställning celler med ljusa fältet belysning. Röda lysdioder är särskilt bra eftersom de inte innebära betydande foto skador.
- Växla till laser belysning och välja lämpliga lasrar och filterkombinationer att excitera fluoroforer ival. Se till att TIRF vinkeln är underkritiska, annars kommer du inte kunna upptäcka någon signal som härrör från GFP fusionsproteiner. Om du är osäker inställd TIRF vinkel 0 ° för att erhålla en stråle vinkelrätt laser. Finna den övre sektionen av cellen (sidan av cellen är vänd mot täckglas). Ändra infallsvinkeln av laserstrålen tills signalerna försvinner sedan långsamt öka vinkeln till en punkt där fluorescensen på igen cellytan (Film 2). Justera z fokusera igen för optimal position på ytan. Godtagbara TIRF vinklar skapar någon suddig halo vid kanten av cellen (Fig. 1C). Om signifikant fotoblekning inträffar under installationen, spara TIRF vinkel och flytta till en oblekt skede ställning innan förvärvet.
- Justera laserintensiteter och kameran förstärkning för att maximera dynamiskt område (högt signal-brus-förhållande utan att mätta pixlar). Vanligtvis EMCCD kameror är optimalt att detektera mycket låga signaler vid hög signal-brus-råttaIos. För starkare signaler vanliga CCD-kameror ger mindre buller och erbjuda ett bredare dynamiskt omfång.
- TIRF-mikroskopi är mycket känslig för små höjdskillnader av täckglaset, vilket resulterar i endast ett fåtal celler, som kan avbildas samtidigt (figur 1D). För små celler förvärvet region (region av intresse, ROI) kan därför ofta reduceras till en underregion innehållande föremål för val. Detta minskar också den tid som behövs för att överföra data från chip till hårddisk, ofta hastighetsbegränsande steget vid höga frame rates.
- För dubbel färg TIRF försök se till att minimera blödning genomgång av fluoroforer. För RFP / GFP par använda separata utsläpp filter som RFP är svagt exciteras av 488 nm ljus (Fig. 2A). De flesta filter är inte perfekt i linje med varandra. Filtrera offset kan korrigeras med hjälp av fluorescerande pärlor blandade med celler. För att uppnå jämförbara penetrationsdjupet, justera TIRF vinklar sig for varje laser linje. Ett typiskt arbetsflöde visas i figur. 2B.
- En kritisk parameter som påverkar bildkvaliteten är laser inriktning och en rent objektiv. Om du vill justera lasern, först fokus på z-positionen för TIRF avbildning. Därefter bort provet och rengöra från syftet med olja (kvarvarande oljan leder till diffraktion av laserljus och fläckar i strålprofilen). Projekt lasern på taket i TIRF läge och kalibrera 0 ° läge så att lasern är i en rak linje med målet (använd referens plats, alltid bära skyddsglasögon lasersäkerhet och undvika alla reflektioner i strålgången). Fokus lasern plats till en minimal storlek. Vår inställning ger en rörlig lins placeras mellan galvos och mikroskop för att underlätta snabb kalibrering. Efter optimal justering bör lasern profilen bildar en väl definiera plats med ungefär rund form. Utför kalibrering före varje session för att erhålla optimal bildkvalitet.
3. Representativa resultat
- Fördelningen av aktin homologer och cell enzymer vägg i Bacillus subtilis. Vi avbildas celler som uttrycker GFP fusioner av aktin-homologen MBL eller den transpeptidas PbpH genom TIRF och regelbunden epifluorescens. Penetrationen djup i TIRF är klart minskas och begränsas till den yta som vetter mot täckglaset (Fig. 3A, B). Den svagt uttryckt transpeptidas PbpH lokaliseras till kortikala patchar som knappast synlig genom epifluorescens men kan särskiljas klart genom TIRF (Fig. 3B). Den minskade penetration kan bäst observeras för PbpHGFP signal vid septa, som visas som linjer i epifluorescens utan som prickar i TIRF (Fig. 3B, pil).
- Proteindomäner i jäst plasmamembranet. Exempel på nätverksliknande mönster som bildas av plasmamembranproteiner i jäst är redan given FIG. 1C och2. Utöver den förbättrade kontrasten i TIRF som tillåter tydlig skillnad i dessa nät-liknande mönster kan svaga signaler ibland upptäckas uteslutande av TIRF mikroskopi. Såsom exempel avbildas vi en GFP fusion av TORC2 komplex komponent Bit61 från Saccharomyces cerevisiae. Detta protein är svagt uttrycks och bildar små kortikala fläckar med endast ett fåtal protein kopior per patch 9. I epifluorescens bara några fläckar syns ovanför stark bakgrund, medan plåster kan avbildas med mycket god signal-brus-förhållandet i TIRF (Fig. 3C). Därför TIRF är särskilt väl lämpad för att studera svagt fluorescerande strukturer och proteiner på cellytan. Den höga axiella upplösningen från TIRF reducerar redan bakgrundsfluorescens. Ytterligare förbättring av bildkontrasten kan erhållas genom olika steg bildbehandlingstekniker. En enkel standardteknik är lokal bakgrunden utjämning där en suddig bild subtraheras frånoriginalet. Suddighet kan utföras med en mängd olika lågpassfilter innefattande median-eller Gauss-filter (fig. 3D). Lokal bakgrundssubtraktion bort brus och skärper hög intensitet strukturer. Men kommer det ofta till priset av en förlust av fina strukturer och överdriven förstärkning av högintensiva regioner (Fig. 3D, pil). En överlägsen förfarande är 2D avfaltning, som kan utföras med fria eller kommersiellt tillgängliga programpaket som ImageJ, Matlab eller Huygens (Scientific Volume Imaging BV). TIRF bilder ger mycket god axiell upplösning och därför en nästan tvådimensionell punktspridningsfunktion (PSF). Vi bestämde experimentellt detta polyesterstapelfibrer genom förvärv av bilder av 40 nm fluorescerande pärlor med samma inställningar som användes för den aktuella avbildning (objektiv, kamera, excitation och emission våglängd) Den experimentella polyesterstapelfibrer sedan användes för avfaltning med en klassisk maximum likelihood algoritm i Huygens. Tidförfaller filmer av GFPRas2 eller Fet3GFP och Pma1RFP (filmer 3 och 4) visar en ökning av kontrasten efter avfaltning. I dubbla färgbilder det är viktigt att maximera kontrast, för att kunna kvantifiera samlokalisering värden (Film 4).
- Analys av protein omsättning på cellens cortex. TIRF och FRAP erbjuder en kraftfull kombination för att studera dynamiken i kortikala proteiner. Emellertid, för att tillåta den effektiva användningen av dessa tekniker, är en snabb kontroll av laser vinklar och positioner krävs. I TIRF, ett brett fält teknik, måste lasern vara fokuserad på baksidan fokalplanet och måste följa en grund infallsvinkel för att uppnå önskad reflektion. I motsats kräver FRAP lasern att fokuseras direkt på provet och placeras med hög rumslig precision för att möjliggöra blekning av definierade strukturer eller regioner. Installationsprogrammet från Tills fotonik vi använde i våra experiment ger mycket snabb och intuitiv kontroll över eese parametrar. Två galvanometer-styrda speglar används för att justera FRAP position i x, y eller för att ställa in infallsvinkeln i TIRF. En tredje spegel används för att växla mellan olika balk vägar för TIRF och FRAP belysning (lasern breddas med ytterligare linser i TIRF vägen). Alla inställningar kontrolleras av LA (live förvärv) programvara och kalibreringar kan snabbt utföras för varje experiment för att uppnå optimala förhållanden. Denna programvara gör det också möjligt definition av blekmedel positioner under bildtagning, vilket är viktigt för FRAP experiment på rörliga strukturer.
Med användning av denna egenskap kunde vi utesluta treadmilling av MBL filament som källa för den observerade motilitet av MBL-innehållande plåster (fig. 3E). Denna observation motiverade vårt sökande efter alternativa motilitet mekanismer och slutligen resulterade i vår identifiering av en helt oväntad typ av rörlighet, där intracellulära proteinkomplex (inklusive MBL) flyttas genom aktiviteterhet av cellväggen syntetisera enzymer som finns på utsidan av cellen 4. På ett liknande sätt, kunde vi observera långsamma omdisponeringar av membranproteiner jäst plasmaproteiner, som distribueras i nätet-liknande domäner som täcker hela cellytan (Fig. 3F).
Dessa exempel illustrerar hur dynamik och mönstring av kortikala proteiner direkt kan bedömas genom att kombinera TIRF och tekniker FRAP.
4. Representativa resultat
Figur 1. Justera parametrar. A. Smutsig vs rengöras samtidigtverslip. Bakgrundssignal följd av damm på täckglaset störa en potentiell GFP / RFP signalen har rengjorts täckglas mindre bakgrund. B. Skräddarsytt el värmeregulator visar inställd temperatur (a), temperatur vid givare (b) och provhållaren (c) . C. Jäst protein Pma1GFP avbildas med minskande infallsvinklar (uppifrån vänster till nederst till höger). Bilderna visar en plötslig förlust av signal vid den kritiska vinkeln och progressiva minskning strukturell information och signal-brus-förhållande. D. Ojämn synfält. En tät suspension av fluorescerande pärlor avbildas, visar att endast en del av synfältet är i fokus. Skalstrecken i A, B: 2 | im, i C: 10 | im.
Figur 2. Double färgbilder. A. blöda igenom i Pil1RFP. Pil1RFP är upphetsadmed 488 nm och en 561 nm laser och fluorescensen registrerades med en dubbel bandpassfilter. Signal Pil1RFP är svagt synlig i GFP-kanalen. Skala bar 2 nm B. Typiska åtgärder för att undvika blödning genom att i dubbel färgbilder. Efter avbildning av cellerna med separata filter uppsättningar, de avfaltade och inriktade (med fluorescerande pärlor) innan de slås ihop för analys.
Figur 3. Representativa resultat. A. Jämförelse av GFPMbl fördelning i B. subtilis med TIRF eller reguljärt epifluorescens (Epi) mikroskopi. Blå: Cell gränsen från ljust fält bild. Bilder representerar genomsnittliga beräkningar av en tidsserie för att indikera det område som täcks av rörliga MreB fläckar övervakas med olika avbildningstekniker lägen. B. Bättre axiell upplösning och kontrast TIRF bildenhar tagit av transpeptidas PbpHGFP i B. subtilis. pilar indikerar septal färgning som visas som ring i epifluorescens och som plåster på TIRF. Exponeringstid. 100 ms C. Jämförelse mellan epifluorescens och TIRF belysning av TOR komplex komponent Bit61 i S cerevisiae.. Bit61 är mycket svagt uttryckt 9. Exponeringstid: 250 ms D. Jämförelse av olika metoder bildbehandling.. Serie visar råa TIRF bild av Pma1GFP, subtraktion av Gaussisk eller medianvärde suddiga bilder, liksom avfaltningsmetoder med maximal sannolikhet algoritmen i Huygens. E. TIRF-FRAP av en enda GFPMbl patch (ovan asterisk) flyttar över en B. subtilis-celler. Den kymograf av den icke-återhämta patch och intensiteten profilen längs kymograf (streckad linje) utesluter treadmilling som källa av rörelse. F. TIRF-FRAP av en jästcell uttrycker Pma1GFP. Notera diffusiva stängning avlucka i den kortikala färgningsmönster. Skalstrecken: 2 ^ m. Tid i sekunder.
Film 1. Film som visar B. subtilis-celler som uttrycker en RFP fusionsproteinet på en smutsig täckglas. Observera att RFP signalen är knappast skiljer sig från bakgrundsljud. Cykeltid 100 ms. Klicka här för att se filmen .
Film 2. Film på Pma1GFP med olika infallsvinklar. Vinkeln ändras från underkritiska till kritisk vinkel, tills signalen går förlorad. Observera, vid underkritiska vinkeln intern signal är synlig, vilket bullriga bilder tills i kritisk vinkel bara proteinet vid PM är synlig. Cykeltid 200 ms. Skala bar: 2 nm. Klicka här för att se filmen .
Filmen 3. Film av jäst GFPRas2, som visar alternatIng RAW-och avfaltade TIRF bilder. GFPRas2 är en snabb rörelse protein (T1 / 2 2s opublicerade data), snabba förvärv tider är viktigt att lösa det dynamiska beteendet. Cykeltid 150 ms. Skala bar: 2 nm. Klicka här för att se filmen .
Movie 4. Dubbelklicka färg filmen av jäst proteiner Fet3GFP och Pma1RFP. Första 10 bilder representerar RAW-bilder och sista ramar avfaltade. Denna film visar på vikten av bildbehandling för samlokalisering analys. De suddiga RAW-bilder blir slipas, vilket gör en analys möjlig. Cykeltiden 5 ar. Skala bar: 2 nm. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF mikroskopi är den teknik som väljs för att bilden perifera proteiner. Den låga penetrationen djup försvinnande området minimerar för oskarp ljus, vilket leder till en mycket bra signal-brus-förhållande och tillåter datainsamling med hög bildfrekvens, eller avbildning av mycket svagt uttryckta proteiner. Kombinationen av hög kontrast och hög chassi gör TIRF mikroskopi ett perfekt verktyg för avbildning spatio-temporala dynamiken i cortically lokaliserade proteiner. Intressant den tjocka cellväggen som omger många mikroorganismer som inte hindrar avbildning av perifera proteiner genom TIRF. I själva verket, den faktiska generering av den evanescenta mycket sannolikt inträffar vid gränsytan mellan cellväggen och plasma 5,10 membran. Reflektion av ljus som lämnar cellen och med kan leda till spridning av ljus längs cellväggen, vilket kan förklara den stora ytarean som kan avbildas i jästceller 8.
För optimal kvalitet TIRF imåldrar är det viktigt att ha en väl kalibrerad mikroskopi system. Lasern bör vara inriktad och anpassas inför varje avbildning session. Täckglasen skall rengöras (Fig. 1 A) och cellerna måste vara ordentligt immobiliseras. För dubbla spektrala färgbilder blöder igenom måste beaktas eller elimineras genom att använda filter uppsättningar filter separat emission sortiment. Detta kommer naturligtvis komma till priset av långsammare förvärv gånger på grund av mekaniskt filter förändring. Snabba filter hjul eller galvanometer drivs källor belysning kan kringgå denna försening om det behövs. Alternativt kan den kritiska fluoroforen (RFP) användas på det uttryckta proteinet svagare i ett par, vilket minimerar Nivån för signalinterferens.
Trots den höga kontrasten, bilder tagna med en TIRF mikroskop innehåller betydande störningar. För att ta bort detta buller och ytterligare öka bild kontrastrika bilder kan bearbetas med olika filtrering steg. Metoden med de bästa resultaten i vårterfarenhet är 2D avfaltning. Detta kräver den experimentella mätningen av polyesterstapelfibrer för varje prov och mikroskop tillstånd. Emellertid kan detta utföras relativt lätt och snabbt med användning av fluorescerande pärlor blandas in i respektive prov. För två färger experiment dessa pärlor kan dessutom användas för kanal inriktning.
Vi har visat fördelarna med att använda TIRF mikroskopi för avbildning av kortikala proteiner i mikroorganismer. Kombination av TIRF och bildbehandling gör det möjligt förvärv av bilder med hög bildfrekvens (<50 ms) och kontrast och möjliggör visualisering av svagt uttryckta proteiner såsom Bit61. En ytterligare fördel med att utföra TIRF avbildning på mikroorganismen är att saftspänningen i dessa celler leder till plana plasmamembran, och minimerar topologiska effekter TIRF-signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Max Planck-sällskapet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
