Vi beskriver en fluorescens reporter analys att snabbt identifiera och karakterisera gener som reglerar musen embryonala underhåll stamceller och själv-förnyelse.
Pluripotens och självförnyelse är två utmärkande egenskaper hos embryonala stamceller (ES-celler). Förstå den underliggande molekylära mekanismen kommer i hög grad underlätta användningen av ES-celler för utvecklingsbiologi studier, sjukdom modellering, läkemedelsutveckling och regenerativ medicin (över 1,2).
För att påskynda identifiering och karakterisering av nya regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse, utvecklade vi en fluorescens reporter-baserad analys för att kvantitativt mäta självförnyelse status i mus ES-celler med hjälp av Oct4GiP cellerna 3. De Oct4GiP celler uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den Oct4 genpromotorregionen 4,5. Oct4 krävs för ES-cell självförnyelse och är mycket uttrycks i ES-celler och snabbt nedregleras under differentiering 6,7. Som ett resultat korrelerar GFP-uttryck och fluorescens i rapportörgenanalysen celler trogetmed ES cellidentitet 5, och fluorescens-cellsortering (FACS) kan analysen användas för att noga övervaka självförnyelse status cellerna vid den enda cellnivå 3,8.
Tillsammans med RNAi kan Oct4GiP reporter analysen användas för att snabbt identifiera och studera regulatorer av ES-celler underhåll och självförnyelse 3,8. Jämfört med andra metoder för analys av självförnyelse, är det mer praktiskt, känslig, kvantitativ, och lägre kostnad. Den kan utföras i 96 – eller 384-brunnars plattor för omfattande undersökningar, såsom hög genomströmning skärmar eller genetisk epistasis analys. Slutligen, genom användning av andra härstamning-specifika reportern ES-cellinjer kan analysen som beskrivs här också modifieras för att studera ödet specifikation under ES-celldifferentiering.
Den Oct4GiP reporter analysen beskriver vi ovan kan kvantitativt mäta omfattningen av självförnyelse vs differentiering. Jämfört med andra tillgängliga metoder, såsom morfologi-baserade 12 och proliferation / viabilitet-baserade analyser, erbjuder den högre känslighet och genomströmning, såväl som en mer direkt mätning av ES-cellen tillstånd. Det är därför väl lämpad för storskaliga skärmar och genetisk epistasis analys. I själva verket har vi och andra använts framgångsrikt analysen O…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Brad Lackford för att läsa och redigera manus. Denna forskning stöds av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Interna Research Program Z01ES102745 (till GH).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.