Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate
Summary
Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.
Abstract
Pluripotenz und Selbsterneuerung sind zwei definierenden Eigenschaften von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen). Das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismus wird dadurch wesentlich erleichtert den Einsatz von ES-Zellen für Entwicklungsbiologie Studien, Krankheit Modellierung, der Wirkstoffforschung und in der regenerativen Medizin (Übersicht in 1,2).
Um die Identifizierung und Charakterisierung neuer Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung beschleunigen, entwickelten wir eine Fluoreszenz-Reporter-basierter Assay zur quantitativen Messung der Selbst-Erneuerung Status in Maus-ES-Zellen unter Verwendung des Oct4GiP Zellen 3. Die Oct4GiP Zellen exprimieren das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des Oct4-Gen Promotor-Region 4,5. Oct4 ist für ES-Zell-Selbsterneuerung benötigt, und ist stark in ES-Zellen exprimiert und schnell herunter reguliert während der Differenzierung 6,7. Als ein Ergebnis korreliert GFP-Expression und Fluoreszenz in den Reporter-Zellen treumit dem ES-Zell-Identität 5 und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Analyse kann verwendet werden, die sorgfältige Überwachung der Selbst-Erneuerung Status der Zellen auf der Ebene der Einzelzelle 3,8 sein.
Gekoppelt mit RNAi, kann die Oct4GiP Reporter Assay verwendet, um schnell zu identifizieren und zu untersuchen Regulatoren der ES-Zell-Wartungs-und Selbst-Erneuerung 3,8 sein. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Bestimmung von Selbst-Erneuerung, ist es bequemer, einfühlsam, quantitative und von geringeren Kosten. Es kann in 96 durchgeführt werden – oder 384-Well-Platten für eine groß angelegte Studien wie High-Throughput-Screens oder genetische Analyse Epistasie. Schließlich wird unter Verwendung anderen Linie-spezifischen Reporters ES-Zelllinien, kann der Assay hier beschriebenen auch modifiziert werden, Determination während der ES-Zelldifferenzierung zu untersuchen.
Protocol
Discussion
Die Oct4GiP Reporter-Assay beschreiben wir oben kann quantitativ messen das Ausmaß der Selbst-Erneuerung vs Differenzierung. Im Vergleich zu anderen verfügbaren Verfahren, wie die Morphologie-basierten 12 und Proliferation / Lebensfähigkeit-basierten Assays, bietet eine höhere Empfindlichkeit und Durchsatz sowie eine direkte Messung der ES-Zelle Zustand. Es wird daher auch für große Bildschirme und genetische Analyse Epistasie geeignet. In der Tat haben wir und andere erfolgreich das Oct4GiP Reporter-As…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Brad Lackford zum Lesen und Editieren des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Research Program Intramural Z01ES102745 (GH) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | Millipore | SF001-500P |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 |
| 100x Nucleosides for ES cell | Millipore | 10620-1 |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522-100ml |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 |
Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5′-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon.
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