Summary
Nós descrevemos um ensaio repórter de fluorescência para rapidamente identificar e caracterizar genes que regulam a manutenção do mouse células-tronco embrionárias e auto-renovação.
Abstract
Pluripotência e auto-renovação são duas características definidoras das células-tronco embrionárias (células ES). O entendimento do mecanismo molecular vai facilitar muito o uso de células-tronco embrionárias para estudos de biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de drogas e da medicina regenerativa (revisto em 1,2).
Para acelerar a identificação e caracterização de novos reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação, foi desenvolvido um ensaio baseado em fluorescência repórter para medir quantitativamente o estado de auto-renovação em células ES de rato usando as células Oct4GiP 3. As células Oct4GiP expressar a proteína verde fluorescente (GFP), sob o controlo da região promotora do gene Oct4 4,5. Oct4 é necessária para a célula ES auto-renovação, e é altamente expressa em células ES e rapidamente para baixo-regulado durante a diferenciação 6,7. Como resultado, a GFP expressão e de fluorescência nas células repórter correlaciona fielmentecom a célula de identidade ES 5, e fluorescência-activated separação de células (FACS) análise pode ser usado para acompanhar de perto o estado de auto-renovação das células ao nível única célula 3,8.
Juntamente com RNAi, o ensaio repórter Oct4GiP pode ser usada para rapidamente identificar e estudar os reguladores de manutenção de células ES e auto-renovação 3,8. Em comparação com outros métodos para ensaiar a auto-renovação, é mais conveniente, sensível, quantitativa, e de menor custo. Ela pode ser realizada em 96 - ou 384-bem placas para estudos em larga escala, tais como de alto rendimento telas ou de análise de epistasia genética. Finalmente, por meio de outros linhagem específicos repórter linhas de células ES, o ensaio descrevemos aqui também pode ser modificada para estudar especificação destino durante a diferenciação de células ES.
Protocol
1. Oct4GiP mouse manutenção de células ES
Células Oct4GiP foram gentilmente fornecido pelo Dr. Austin Smith. Eles foram derivados a partir dos ratinhos 129/Ola que transportam um transgene Oct4-GFPiresPac 4,5. Eles são mantidas em placas revestidas com gelatina de cultura de tecidos em meio ESGRO completa mais clonal grau (Millipore), ou em meio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado com 15% de FBS, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x não- aminoácidos essenciais (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore), e 10 uM β-mercaptoetanol.
- Revestir placas com 0,1% de gelatina (Sigma) à temperatura ambiente durante 30 minutos (0,1 ml gelatina solução cm / 2).
- Placa células Oct4GiP em gelatina-placas revestidas a ~ 2 x 10 4 cm / 2.
- Dividir as células de dois em dois dias com tripsina a 0,05%.
2. Transfection siRNA em células Oct4GiP
O ensaio de repórter Oct4GiP é mais convenienqüentemente realizado em gelatina-revestido fundo plano 96 - ou 384-bem placas (Corning ou BD) no meio de M15. O procedimento geral é descrito na Figura 1.
- siRNA lipídios montagem complexos:
- Para a transfecção em placas de 96 poços, montar siRNA-lipídicos complexos em U-inferior placas de 96 poços.
- Em cada poço, misturar 10 uL OptiMEM (Invitrogen) e 0,3 ul Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Adicionar 5 pmol siRNA à mistura lípido-OptiMEM e incubar durante mais 15 minutos. O siRNA: razão de lípido é de 100 pmol: 6ul.
- Transferir os complexos siRNA-lipídicos em OptiMEM a partir da placa de U-baixo para a gelatina revestido placa de fundo plano com uma pipeta multi-canal.
- Para a transfecção em 384 poços, preparar os complexos siRNA-lipídicos utilizando Lipofectamine 0,1 uL de 2000 e 2 pmol siRNA em 10 OptiMEM uL.
Nota: A concentração final em siRNAas transfecções é de 50 nM. Realizar biológica 3-4 repetições para cada transfecção do siRNA. Configure misturas mestras dos complexos siRNA-lipídicos na placa de U-bottom e alíquota para o plano de fundo chapa de gelatina-revestido.
- Oct4GiP plaqueamento de células e de transfecção:
- Para a transfecção em placas de 96 poços, recolher as células Oct4GiP e ressuspender em meio M15-los fresco a 9 x 10 4 células / ml.
- Adicionar 100 uL da suspensão de células para cada poço utilizando uma pipeta multi-canal.
- Misturar a suspensão de células com os pré-alíquotas siRNA lípidos complexos no poço por pipetagem cima e para baixo 3-5 vezes. Alterar dicas para transfecções siRNA diferentes.
- Para a transfecção em placas de 384 poços, as células Oct4GiP Ressuspenda a 6 x 10 4 células / ml e 30 aliquota de suspensão de células uL a cada poço.
Nota: A densidade de plaqueamento óptima de células é geralmente de 3 x 10 5 células / cm 2, mas may requerem otimização de siRNAs que afetam drasticamente o crescimento celular ou viabilidade. Densidade plaqueamento baixa irá conduzir a sobrevivência da célula pobre durante a transfecção. Densidade de plaqueamento alta levará a fundo elevado, devido à elevada diferenciação celular induzida confluência. Se necessário, a densidade de plaqueamento de ensaio entre 2-4 x 10 5 células / cm 2.
- Troca de meio:
- Remova o meio de idade, utilizando multi-canal de aspiração (Corning) ou vácuo varinha (VP-Científico). Ter cuidado para não riscar as células no fundo das placas.
- Alimentar as células com meio fresco de células ES (100 uL para a placa de 96 poços e 30 uL de 384-bem placa) usando uma pipeta multi-canal a cada dia.
3. Análise FACS
- Dissociação celular:
- Quatro dias após a transfecção, remover média usando multi-canal de aspiração (Corning) ou de vácuo varinha (VP-Scientific).
- Para placas de 96 poços, lavar as células uma vez com 100μl de PBS.
- Adicionar 25 ul de tripsina a 0,25% a cada poço utilizando uma pipeta multi-canal.
- Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos com agitação ocasional, e inspeccione visualmente para assegurar separação completa das células.
- Adicionar 90 ul de PBS com FBS 10% para inactivar a tripsina e dissociam-se as células em uma única suspensão celular por pipetagem repetida.
- Para 384 poços, dissociar as células com 10 ul de tripsina e extingue-se com 30 ul de PBS com FBS 10%.
- Análise FACS:
- Analise a fluorescência da GFP no analisador FACS BD LSRII equipado com a unidade de HTS ou outro com o mesmo equipamento analisador FACS (tais como Accuri ou Intellicyt).
- Utilizar o modo de alto rendimento no HTS e analisar 10 ul de suspensão de células. Definir o limite de contagem de 1,0 x 10 4 células.
- Ajuste a tensão PMT e limiar para capturar as células na trama para frente contra o dispersor lateral. Porta para a população de células vivas no FORWard vs enredo lado dispersão.
- Criar um histograma para o canal de GFP. Definir o portão no canal de modo que a GFP ~ 10% das células parecem ser GFP-negativa nas células simulados ou controlo siRNA-transfectadas.
- Determinar% GFP-negativas células de cada tratamento: células diferenciadas% =% GFP-negativas células. Compare as células diferenciadas% entre experimentais e controle de siRNA-transfecções usando 2-tailed t-teste, e marcar as visitas positivas com valores de p <0,01.
4. Os resultados representativos
Oct4, Nanog, e Sox2 são três genes que desempenham papéis cruciais na manutenção da célula ES auto-renovação 6,7,9-11. Figura 2 mostra que o ensaio de repórter Oct4GiP pode facilmente detectar a diferenciação causada por silenciar estes factores no células-tronco embrionárias Oct4GiP.
A Figura 2A mostra as células ES são Oct4GiP GFP-positivo quando mantidos como ES células. Figura 2B mostra o gráfico de dispersão para a frente vs lado e do histograma do canal de GFP das células Oct4GiP transfectadas com o controlo ou Oct4 de siRNAs. É necessário portão para células vivas no gráfico de dispersão para a frente vs lado, como as células mortas e detritos são GFP-negativa e irá aumentar de fundo. Por outro lado, dupleto discriminação para excluir aglomerados de células possíveis nem sempre é necessária. Nas células de controlo siRNA-transfectadas, a grande maioria das células deve ser GFP-positivo. Se óbvias GFP-negativas populações estão presentes nos poços de controlo de siRNA-transfectadas, as células Oct4GiP de partida ou o procedimento de transfecção pode ter sido comprometida eo resultado pode não ser interpretável.
A Figura 2C mostra o gráfico de barras de células diferenciadas% (células diferenciadas% =% GFP-negativas células) do controle, Oct4-, NANOG-, e Sox2 siRNA-células transfectadas.
d/3987/3987fig1.jpg "/>
Figura 1. Esboço do ensaio repórter Oct4GiP.
Figura 2. Oct4GiP ensaio repórter pode detectar diferenciação de células ES causada por Nanog, Oct4, ou silenciamento Sox2. A) E14Tg2a (de tipo selvagem de linha, preto) e Oct4GiP (linha verde), as células foram analisadas por FACS. Histograma da GFP-canal mostra que as células são Oct4GiP GFP-positivo. B) As células foram transfectadas Oct4GiP em placas de 96 poços com o controle ou Oct4 siRNA e FACS analisados 4 dias após a transfecção. As células para a frente vs parcelas laterais de dispersão e histogramas da GFP-canal das células transfectadas são mostrados. C) Oct4GiP foram transfectadas com o Controlo-,-Nanog, Oct4-, ou-Sox2 siRNA. As células diferenciadas% foi determinada a partir da% GFP-negativa células 4 dias após a transfecção, e foi desenhado como média + / - erro padrão da média (n = 4).f = "http://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver maior figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio repórter Oct4GiP descrevemos acima pode medir quantitativamente o grau de auto-renovação vs diferenciação. Em comparação com outros métodos disponíveis, tais como o 12 baseada na morfologia e proliferação / viabilidade baseado ensaios, oferece uma maior sensibilidade e rendimento, bem como uma medição mais directa do estado de células ES. É, portanto, bem adequado para grande escala telas e análise epistasia genética. Na verdade, nós e os outros têm utilizado com sucesso o ensaio repórter Oct4GiP para as telas do genoma RNAi 3,8. Como todos os ensaios, no entanto, também tem limitações. Só pode ser usado para estudar os genes que directa ou indirectamente regulam Oct4 actividade de promotor, e pode falsamente identificar genes que afectam a expressão da GFP, a estabilidade, ou a função de pós-transcricionalmente. Assim, ensaios adicionais ou telas secundárias, tais como coloração fosfatase alcalina 13 (Millipore, SCR004) e coloração de imunofluorescência ou quantitativa RT-PCR de marcadores de pluripotência 3,8,12,14 são necessários para confirmar os resultados obtidos com este método.
O ensaio de repórter Oct4GiP depende silenciamento do gene eficiente. SiRNAs eficazes e eficientes transfecções siRNA são a chave para o sucesso do ensaio. Embora apenas descrita a utilização do ensaio de repórter com transfecções siRNA, o ensaio pode também ser realizada com transfecções de DNA para o silêncio ou genes superexpressam de interesse. A eficiência de transfecção de ADN é geralmente menor do que a de siRNAs e pode reduzir a resistência do fenótipo.
Além do que foi descrito neste protocolo, o ensaio repórter Oct4GiP pode ser modificado para identificar e caracterizar genes que regulam negativamente a auto-renovação também. Nesse caso, as células podem ser transfectadas com siRNAs e cultivadas em condições de diferenciação. Silenciamento de reguladores negativos de auto-renovação irá melhorar a auto-renovação e sustentar a GFP expressão, que pode ser detected por FACS da mesma forma como descrito no protocolo de corrente.
Além das células repórter Oct4GiP, as linhas de células utilizando outros repórter promotores específicos de células ES, tais como o Nanog-GFP 15-18 (Millipore, SCR089) e Rex1-GFP 19 células, também têm sido gerada. Eles também podem ser usados para estudar célula ES auto-renovação e de manutenção usando a mesma estratégia. No entanto, porque não há diferença perceptível na actividade e especificidade destes promotores de células ES gene marcador, estas linhas de células repórter se comportam de maneira diferente em termos de nível de fundo e sensibilidade e, assim, se complementam. Finalmente, por meio de outros linhagem específicos repórter linhas de células ES, a nossa estratégia pode ser modificado para estudar o destino de especificação de células ES e facilitar a utilização de células ES como um modelo in vitro para o desenvolvimento precoce de mamífero.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Brad Lackford para leitura e edição do manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental, National Institutes of Health Research Program intramuros Z01ES102745 (GH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ESGRO complete plus clonal grade medium | EMD Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (High glucose 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM(reduce serum medium) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO mLIF (107 units/1ml) | EMD Millipore | DAM1776540 | |
| MEM NEAA (Non-Essential Amino Acids) | Invitrogen | 11140 | |
| 100x Nucleosides for ES cell | EMD Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ml | |
| ES-qualified fetal bovine serum | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058489-01 | |
| Control siRNA: siRNA duplex targeting firefly luciferase (5’-CGTACGCGGAATACTTCGA) synthesized by Dharamcon. | |||
References
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132, 661-680 (2008).
- Hu, G. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal. Genes Dev. 23, 837-848 (2009).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. Changing potency by spontaneous fusion. Nature. 416, 545-548 (2002).
- Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Nichols, J. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95, 379-391 (1998).
- Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).
- Ding, L. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).
- Chambers, I. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, 643-655 (2003).
- Masui, S. Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).
- Mitsui, K. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113, 631-642 (2003).
- Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell. 134, 162-174 (2008).
- Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor. 141, 344-352 (1990).
- Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144, 940-954 (2011).
- Chambers, I. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450, 1230-1234 (2007).
- Maherali, N. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Rodda, D. J. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).
- Schaniel, C. Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells. Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).
- Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture. Development. 135, 909-918 (2008).
