En snabbare, högupplöst, MTPA-GFP-baserade Mitokondriell Fusion analys förvärva Kinetiska Uppgifter om flera celler parallellt med användning av konfokalmikroskopi

Summary

Mitokondriell fusion mättes genom att spåra utjämning av photoconverted matrix målinriktat GFP över mitokondriella nätverket över tid. Så här långt, kan endast en cell skall utsättas för en timmes kinetisk analys vid en tidpunkt. Vi presenterar en metod som samtidigt mäter flera celler, vilket snabbar upp insamlingen av uppgifter.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Bild Plate Preparation Kultur INS1 celler i RPMI medium innehållande 10% standard fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin, 50 | iM 2-merkaptoetanol, 5 mM NaHCOs 3, 2 mM HEPES, 2 mM pyrodruvsyra och 11 mM glukos till 80% konfluens. Trypsinisera de INS1 cellkulturer med 0,05% trypsin och plattan dem på poly-D-lysin-belagda täckglas-bottnade avbildande plattor (30-40% konfluens). Låt för plåtar för att nå 60-80% konfluens (~ 2 dagar) och tillsätt mitokondriens matrix riktade (COXVIII) adenovirala PA-GFP under 24 timmar (MOI = 5). Växlingsmediet och tillåter celler att växa under ytterligare 2 dagar före avbildning. På dagen för avbildning, tillsätt 7-15 nM TMRE till avbildande plattorna, och jämvikt under minst 45 minuter. Under denna tid sväng på inkubatorn (steg övre inkubator har använts här) och låt mikroskop för att ekvilibrera till 37 ° C under ca 1 timme. Slå på 5% CO2. </li> 2. Imaging Parametrar för Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop Efter mikroskopet har jämvikt, under Förvärv fliken, klicka på "Visa manuella verktyg", öppnar avbildning som panelen, och välj "kanal läge" och växla spåra varje "frame". Mot bakgrund vägen panelen, välj LSM och kanal-läge. Arbeta från provet ikonen uppåt, välj "bakre", MBS 690 + och MBS 488. Vid botten av panelen genom att välja "T-PMT" för att möjliggöra visualisering av den ljusa fält eller DIC kanal. Avsluta om justering av ljusvägen parametrar genom att ställa in området för GFP färgämnet till 490-540 nm och att 580-700 nm för färgämnet TMRE. I förvärvet läget använder en 512 × 512 fältet bildelementavsökning, genomsnittliga 4x och välja en zoomfaktor (som du kanske vill behålla konsekvent för kalibrering). 3. Optimera Imaging Parametrar Använda planen apochromat 100x (1,4 NA) objektiv, FOCoss på dina celler med halogen ljus, inte fluorescerande ljus, för att skydda mitokondrier från fototoxicitet. Screen för PA-GFP-uttryckande celler med användning av maximalt öppen por och skanning för att hitta de celler som är ljusare grön. Hitta lägsta effekten av 2-fotonen laser behövs för att aktivera PA-GFP och optimera avbildning parametrarna ser till att signalen inte mätta detektorn. Kontrollera att PA-GFP-signal colocalizes med TMRE signalen för några z-serien. Förlust av TMRE indikerar mitokondrie depolarisering eller fototoxicitet, och celler uppvisar dessa egenskaper bör inte användas för analys. Hitta en PA-GFP-uttryckande celler och ange en zoomfaktor. Ställ z-serie att samla 6 skivor (detta område kommer att behöva tillfredsställa alla 10 celler om inte en specifik z-fokus är inställt vid varje position). Spara det bildgivande förfarande för varje cell (cell 1, cell 2 mm). 4. Justera Automated del av programmet och utse de 10 celler som du kommer att följa för 1 timme Mitochondrial Fusion analys På den vänstra panelen i multitime fönstret, välj "spara" panel, och ange platsen där filerna ska sparas. I "Acquisition" panel, ladda förvärvsmetoden sparas för cell 1 i scan-konfiguration och kontrollera z stacken rutan. Även välja "markerad Z-mitten av Z stack". I "block" väljer du "single-block på varje plats". Klicka på "Lägg block" för varje intervall som skall mätas. I "timing" väljer du "vänta-intervall" och skriv "0" i "vänta intervall före block på första plats bara". Block 2-4 kommer att ha "15 min" i detta avsnitt. På den plats på panelen, välj "flytta fokus för att ladda läge mellan orter" och "last igenom config när" flyttar till LOC "eller" nästa loc "klickade. Under" redigera platserna lista "välj" rensa alla "och välj sedan" flera platser motoriserade stadiet ". UndER på "Bleach" panel, klicka på "lut" rutan, och ange konfigurationsfilen i "config" rullgardinsmenyn, som utsetts i fönstret av de viktigaste programvaran. Sedan i "blekning" fönstret, spara lämplig fotoaktivering metoden. I regionerna panelen, välj ROI för just denna cell och lägga till ROI på multitime genom att välja "Lägg till aktuell region till ROI lista"-fönstret. Var noga med att välja samma plats i "ROI" rullgardinsmenyn. För att tidtagningen ska fungera korrekt och för varje cell har en 15 minuters intervall, två metoder måste sparas. I listan av block, kommer den första har "riktiga" fotoaktivering konfiguration och resten kommer att ha en "mock" konfiguration som inte använder två-photon laser. Det första blocket kommer också att vara den enda block som inte har en fördröjning (BKIntv = 0). Därför börjar metoden med en baslinje avsökning, följs av en fotoaktivering avsökning. Resten av blocken har en 900 sek BkIntv, ochvid varje tidpunkt finns det två avsökningar lika vid tiden 0 sek, för att bibehålla timingen konsistens. För var och en av de 10 celler som skall följas över tiden, utför denna sekvens: Hitta en PAGFP uttrycker cell-rädda sin avbildningsmetod Plats panel-markera scenen positionen anger avbildningsmetod Huvud ROI panel-välj en region av intresse att fotoaktiverade Bleach panel-sparar specifika ROI och även ladda den i ROI rutan: Radera ROI och återställa skanningen zooma till 1 Hitta nästa cell och ställ in zoom Upprepa processen för de kommande 9 celler Kontrollera att varje steg plats och alla block ha lämplig avbildningsmetod (scan konfiguration) förknippas med. Se också till att det första blocket på varje plats motsvarar det fotoaktivering metoden medan resten innehåller en "mock"-metoden. Slutligen, välj "kör". 5. Analysera PA-GFP signalstyrkan <li> För de celler där fotoaktiverbara-GFP-signal colocalizes med den röda TMRE signalen, subtrahera bakgrunden i PAGFP bilderna (här använder vi metamorfa). Därefter exportera data till Excel och beräkna den genomsnittliga intensiteten för z-stackar vid varje tidpunkt. Släng optiska delar som inte har någon signal. Mäta signalen spädning i varje z-stapel genom att beräkna den procentuella andelen av den ursprungliga fotoaktiverade signalen. Varje datapunkt scannas och registreras två gånger, vilket resulterar i duplikat z-stacken för varje tidpunkt. Kontrollera att z-stack värden överens. Om inte, vilket indikerar ett problem (t.ex. fokus, cellrörelse). 6. Representativa resultat När en fusion händelse inträffar mellan en aktiverad och ej aktiverad PA-GFP mitokondrien, blandar PAGFP inom den mitokondriella matrisen med icke-märkt matris och blir späddes över en större yta, vilket minskar signalintensitet (Figur 1A). I INS1 cellen sker en signifikant minskning i signalintensitet var 15 minuter, tills jämvikt av mitokondriell fusion har uppnåtts (ca 1 timme). Notera att cellen i figur 1B uppvisar nästan fullständig samlokalisering av PA-GFP och TMRE signaler. Vid dessa analyser en mycket låg koncentration av TMRE (15 nM) användes för att hjälpa rikta fotoaktivering av PAGFP, och även för att övervaka cell hälsa. Celler med ett överflöd av depolariserad mitokondrier har ofullständiga samlokalisering av PAGFP och TMRE och bör inte analyseras eftersom denna indikerar antingen fototoxicitet, eller celler i en döende tillstånd. Jämviktstiden för mitokondriell fusion är vanligen 1 h i INS1 celler, när ~ 15% av den mitokondriella volym aktiveras. Ibland, även om en liten yta belyses, de flesta av mitokondrier blivit fotoaktiveras grund att vara mycket nätverk, i vilket fall ytterligare fusion är svårt att upptäcka. Andra celltyper kan uppvisa olika ekvilibreringstider och bör provas vid kortare intervaller och över en längre period för att karakterisera mitokondriella dynamik. Att inhibera mitokondriell sammansmältning kan cellerna placeras i en lipotoxic miljö. Det har tidigare visats att 0,4 mM palmitat fragment mitokondrier, och inhiberar mitokondriell sammansmältning 9. Denna effekt kan ses i figur 2, där mitokondrier fragmenteras, men signalstyrkan i mtPAGFP inte förändras så mycket som under normala förhållanden (figur 1). Därför är utspädning av PA-GFP-signal sannolikt bero på mitokondrie-fusion snarare än fission. I andra celltyper föreslår vi att du använder andra kända sätt att inducera mitokondrie fragmentering, såsom tysta OPA1 som är nödvändig för mitokondriell fusion 14. Figur 1. </strong> Typisk utspädning av PA-GFP signal efter fotoaktivering under en mitokondriell fusion analys. A. PA-GFP blir successivt dimmer på grund av mitokondriella fusion händelser som leder till utspädning av proteinet över ett allt större område som kan ses i dessa projicerade bilder 6 optiska sektioner kvantifieras var 15 minuter. B. TMRE med PA-GFP visar att mitokondrierna är aktiva och inte depolariseras. Klicka här för att visa en större bild . Figur 2. Mitokondriell fusion hämmade med 0,4 mM palmitat minskar utspädningen av PA-GFP. A. Prognoser för 6 optiska sektioner som visar korta mitokondrier med en oföränderlig signalstyrka över tiden. B. samlokalisering av PA-GFP med TMRE visar att mitokondrierna inte depolariserad. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Denna metod gör det möjligt att avbilda cirka 10 celler vid en tid, om förvärvet sker var 15: e minuter efter fotoaktivering. Det exakta antalet celler kommer att bero på hur snabbt man kan lokalisera och markera mtPAGFP uttrycker cellerna i kulturen skålen och hur snabbt man kan ställa in alla program parametrar. För att göra automation smidigt ett jämnt lager av celler bör användas eftersom de angivna z-stack marginaler kommer att gälla för alla celler.

Storleken på denna inledande fotoaktivering området kommer att styra jämvikt tiden. För att kunna mäta mitokondrie fusion, är det viktigt att photoactivate endast 10-20% av nätet, så att spridningen av signal till resten av nätverket kan följas över tid. Om alltför mycket av nätet fotoaktiveras, är det möjligt att en fullständig fusion kommer att ske för snabbt, och händelsen kommer inte att fångas.

Extrem försiktighet måste vidtas för attjustera lasereffekten i två-foton-laser samt TMRE koncentration för att undvika fototoxicitet som leder till mitokondriellt depolarisation. Säkerställa att mtPAGFP signalen colocalizes med TMRE signalen kan hjälpa till att bedöma fototoxicitet och allmänna cell hälsa ^8,15. Belysning med ljus epifluoerescent bör undvikas. Samtidigt söka efter celler som uttrycker mtPAGFP bör pinhole vara maximalt öppen när du skannar med låg effekt 488 nm excitation. Justering av två-foton-lasereffekten att photoactivate tillräckligt PA-GFP för att mäta signalen över 1 timme, men inte till oversaturate någon av cellerna kan vara svårt ^8. Bör dock tiden spenderas i denna optimering steg eftersom när automatiserat program startas, är det jobbigt att stoppa det, att välja fler celler och återuppta.

För kvalitetskontroll, förvärv av en differential interferens kontrast (DIC) bild (eller överföras ljus) för att övervaka fokus på cellerna kan vara myckethjälpsamma och också ett bra sätt att upptäcka bubblor som bildas i immersionsolja vid skanning, vilket händer ibland från rörelser på scenen.

Även med denna mtPAGFP metod samlar uppgifter om enkelriktade flödet av mitokondriens matrix proteiner från fotoaktiveras mitokondrier till dem som inte är märkta, är det tänkbart att utnyttja denna teknik för att studera andra processer. Till exempel kan specifika fluorokromer fästas membranproteiner för att observera deras specifika rörelser under fusionshändelser, vilket har visats för ABC-mig, fusion av vilka inträffar på en annan tidsskala från blandningen av lösliga matrisproteiner ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss