Summary
De fusion mitochondriale a été mesurée par le suivi de l'équilibrage de photoconverted matrice ciblée GFP à travers le réseau mitochondrial au cours du temps. Jusqu'à présent, une seule cellule pourrait être soumis à une analyse cinétique à long heure à une heure. Nous présentons une méthode qui permet de mesurer simultanément plusieurs cellules, ce qui accélère le processus de collecte de données.
Protocol
1. Préparation plaque image
- Culture Ins1 cellules RPMI contenant 10% sérum de veau fœtal norme, 1% de pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 50 uM de 2-mercaptoéthanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM d'HEPES, 2 mM d'acide pyruvique, et 11 mM de glucose à 80% de confluence.
- Trypsiniser les cultures de cellules Ins1 avec de la trypsine 0,05% et la plaque-les sur la poly-D-lysine plaques revêtues d'imagerie lamelle à fond (% de confluence 30-40).
- Autoriser pour les plaques pour atteindre la confluence de 60-80% (environ 2 jours) et ajouter de la matrice mitochondriale ciblé (COXVIII) adénoviral PA-GFP pendant 24 heures (MOI = 5). Les médias de change et permettent aux cellules de croître pendant encore 2 jours avant l'imagerie.
- Le jour de l'imagerie, ajouter 7-15 TMRE nM à des plaques d'imagerie, et s'équilibrer pendant au moins 45 min.
- Durant ce tour de temps sur l'incubateur (étage supérieur incubateur a été utilisé ici) et permettre le microscope à s'équilibrer à 37 ° C pendant environ 1 heure. Allumez le 5% de CO 2.
2. Paramètres d'imagerie pour l'Zeiss LSM 710 Microscope confocal
- Après le microscope a équilibré, sous l'onglet Acquisition, cliquez sur "outils" manuel montrent, ouvrez l'imagerie mis en place un groupe spécial, et choisissez "mode de canal" et passer le suivi de chaque "frame".
- Dans le panneau trajet de la lumière, choisissez LSM et le mode de canal. De travail de l'icône vers le haut spécimen, sélectionnez "arrière", MBS 690 +, et MBS 488. Au bas du panneau, choisissez "T-PMT" pour permettre la visualisation du champ lumineux ou d'un canal DIC.
- Terminer le réglage des paramètres de chemin de lumière en définissant la plage pour le colorant GFP à 490-540 nm et 580-700 nm pour à la teinture TMRE.
- Dans le mode d'acquisition, d'utiliser un 512 × 512 pixels champ de balayage, 4x moyenne, et choisissez un facteur de zoom (que vous pouvez vouloir garder cohérente à des fins d'étalonnage).
3. Optimiser les paramètres d'imagerie
- Utilisation de la apochromatique plan de 100x (1,4 NA) objectif, focnous sur vos cellules avec la lumière halogène, pas une lumière fluorescente, pour protéger les mitochondries de phototoxicité.
- Écran pour PA-GFP cellules exprimant l'aide d'un sténopé ouverture maximale et la numérisation pour trouver les cellules qui sont plus lumineux vert.
- Trouver la plus faible puissance du laser 2-photons nécessaire pour activer le PA-GFP et d'optimiser les paramètres d'imagerie veillant à ce que le signal ne sature pas le détecteur. Vérifiez que le signal PA-GFP co-localise avec le signal TMRE pour quelques z-series. La perte du signal TMRE indique dépolarisation mitochondriale ou de la phototoxicité, et les cellules présentant ces caractéristiques ne doivent pas être utilisés pour l'analyse.
- Trouver une cellule PA-GFP exprimer et de spécifier un facteur de zoom.
- Définissez la plage de la série Z de recueillir 6 tranches (cette gamme aura besoin pour satisfaire l'ensemble des 10 cellules, sauf si un particulier z-focus est défini à chaque position).
- Enregistrer la méthode d'imagerie, pour chaque cellule (cellule 1, cellule 2, etc).
4. Réglez le AutomatePortion d du Programme et de désigner les 10 cellules que vous suivrez pour le dosage de 1 heure Fusion mitochondriale
- Sur le panneau gauche de la fenêtre MultiTime, sélectionnez l'option "économie" du panneau, et spécifiez l'emplacement où les fichiers seront sauvegardés.
- Dans l '"acquisition" du panneau, de charger la méthode d'acquisition enregistrés pour la cellule 1 dans la configuration de numérisation et cochez la case pile z. Vous pouvez aussi choisir "marqué Z-milieu de pile z".
- Dans le "blocs" du panneau, sélectionnez "seul bloc à chaque endroit». Cliquez sur "ajouter" pour les blocs de chaque intervalle à mesurer.
- Dans le "timing" du panneau, sélectionnez "attendre l'intervalle" et tapez "0" dans le "délai d'attente avant le bloc au premier emplacement seulement". Blocs 2-4 aura "15 min" dans cette section.
- Dans le panneau Emplacement, choisissez "déplacer le focus pour charger la position entre les emplacements" et "charge numériser config quand« passer à loc »ou« la prochaine loc 'cliqué. Dans le cadre du "endroits Modifier la liste" choisir "effacer tout", puis sélectionnez «multiple endroits motorisé stade ".
- Under la "Bleach" panel, cliquez sur le "blanchiment" boîte, et de désigner le fichier de configuration dans le répertoire "config" dans le menu déroulant, tel que désigné dans la fenêtre principale du logiciel. Puis, dans le "blanchiment" fenêtre, enregistrer la méthode appropriée photoactivation. Dans le panneau régions, choisissez le retour sur investissement pour cette cellule particulière, et d'ajouter cette ROI à l'MultiTime en choisissant "add région actuelle à la liste ROI" fenêtre. Veillez à sélectionner l'emplacement même dans le "ROI" dans le menu déroulant.
Pour le moment pour fonctionner correctement et pour chaque cellule d'avoir un intervalle de 15 minutes, deux méthodes ont besoin d'être sauvé. Dans la liste des blocs, le premier aura la configuration «réel» photoactivation, et le reste aura une "maquette" de configuration qui n'utilise pas le laser à deux photons. Le premier bloc sera également le seul bloc qui n'a pas de retard (BKIntv = 0). Par conséquent, la méthode commence par un balayage de base, suivie d'une analyse photoactivation. Le reste des blocs ont une 900 sec BkIntv, età chaque point temporel, il ya deux balayages comme au temps 0 s, afin de maintenir la cohérence de synchronisation.
- Pour chacune des 10 cellules à suivre au fil du temps, d'effectuer cette séquence:
Trouvez une cellule exprimant PAGFP-sauver sa méthode d'imagerie
Lieu panneau marquer la position stade, préciser la méthode d'imagerie
Principal ROI panneau choisir une région d'intérêt à Bleach photoactivé panneau enregistrer un retour sur investissement spécifique et de le charger dans la boîte de retour sur investissement:
Effacer le retour sur investissement et de réinitialiser le zoom de balayage à 1
Trouvez la cellule suivante et régler le zoom
Répétez le processus pour les 9 prochains cellules
Vérifiez que chaque emplacement scène et tous les blocs ont la méthode d'imagerie appropriée (scanner de configuration) associé. Assurez-vous également que le premier bloc à chaque endroit correspond à la méthode appropriée photoactivation tandis que le reste contenir une "maquette" méthode. Enfin, sélectionnez «Exécuter».
5. Analyser l'intensité du signal PA-GFP
- Puis exporter les données vers Excel et calculer l'intensité moyenne de z-piles à chaque instant. Supprimer sections optiques qui n'ont pas de signal.
- Mesurer la dilution du signal dans chaque z-pile en calculant le pourcentage du signal original photoactivé.
Chaque point de données est numérisé et enregistré deux fois, résultant en double z-stack informations pour chaque point dans le temps. Vérifier que les valeurs z-stack d'accord. Si ce n'est pas, ce qui est révélateur d'un problème (par exemple la cellule accent mouvement,).
6. Les résultats représentatifs
Lorsqu'un événement se produit la fusion entre une activé et non activé PA-GFP mitochondrie, l'intérieur de la matrice PAGFP mitochondriale mélange avec la matrice non marqué et devient diluée sur une grande surface, diminuant le signalintensité (figure 1A). Dans la cellule INS1, une diminution significative de l'intensité du signal se produit toutes les 15 minutes, jusqu'à ce que l'équilibrage de la fusion mitochondriale a été atteint (environ 1 heure). Notez que la cellule dans la figure 1B présente colocalisation presque complète de PA-GFP et les signaux TMRE. Dans ces essais une très faible concentration de TMRE (15 nM) est utilisé pour aider à cibler la photoactivation de PAGFP, et aussi pour surveiller la santé des cellules. Les cellules avec une abondance de mitochondries dépolarisée aura colocalisation incomplète de PAGFP et TMRE et ne doit pas être analysé, car cela indique soit la phototoxicité, ou des cellules dans un état de mourir.
Le temps d'équilibrage pour la fusion mitochondriale est généralement de 1 h dans Ins1 cellules, quand ~ 15% du volume mitochondrial est activé. Parfois, même si une petite zone est éclairée, la plupart des mitochondries deviennent photoactivé en raison d'être hautement en réseau, dans ce cas de fusion plus difficile à détecter. D'autres types cellulaires peuvent présenter des temps d'équilibrage différents et devraient être testés à des intervalles plus courts et sur une plus longue période pour caractériser la dynamique mitochondriale. Pour inhiber la fusion mitochondriale, les cellules peuvent être placés dans un environnement lipotoxic. Il a été précédemment démontré que 0,4 mM de palmitate fragments mitochondries, et inhibe la fusion mitochondriale 9. Cet effet peut être vu dans la figure 2, où les mitochondries sont fragmentées, mais l'intensité du signal de l'mtPAGFP ne change pas autant que dans des conditions normales (Figure 1). Par conséquent, la dilution du signal PA-GFP est susceptible d'être due à la fusion mitochondriale plutôt que la fission. Dans les types d'autres cellules, nous vous suggérons d'utiliser d'autres moyens connus pour induire la fragmentation mitochondriale, comme faire taire OPA1 qui est nécessaire pour la fusion mitochondriale 14.
Figure 1. A. PA-GFP devient progressivement gradateur en raison d'événements de fusion mitochondriales conduisant à la dilution de la protéine sur une surface croissante comme on peut le voir sur ces images projetées de 6 sections optiques quantifié toutes les 15 minutes. B. TMRE avec le PA-GFP montre que les mitochondries sont actives et non dépolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Fusion mitochondriale inhibée par 0,4 mM de palmitate diminue la dilution de PA-GFP. Projections A. de 6 sections optiques montrant mitochondries court avec une intensité de signal immuable au fil du temps. Colocalisation B. PA-GFP avec TMRE montre que les mitochondries ne sont pas depolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Discussion
Cette méthode permet l'imagerie de près de 10 cellules à la fois, si l'acquisition se produit toutes les 15 minutes après photoactivation. Le nombre exact de cellules dépendra de la rapidité avec laquelle on est capable de localiser et de marquer les cellules exprimant mtPAGFP au sein de la boîte de culture, et comment on peut rapidement mettre en place tous les paramètres du logiciel. Pour l'automatisation le bon déroulement d'une couche même de cellules doit être utilisé parce que les désignés Z-stack marges s'appliquera pour toutes les cellules.
La taille de cette zone photoactivation initiale régira le temps d'équilibration. Pour être capable de mesurer la fusion mitochondriale, il est important de photoactiver seulement 10-20% du réseau, tels que la propagation du signal au reste du réseau peut être suivi dans le temps. Si elle est trop grande partie du réseau est photoactivé, il est possible que la fusion complète aura lieu trop rapidement, et l'événement ne sera pas capturé.
Un soin extrême doit être prise àajuster la puissance du laser du laser à deux photons ainsi que la concentration TMRE pour éviter phototoxicité qui conduit à une dépolarisation mitochondriale. Veiller à ce que le signal mtPAGFP co-localise avec le signal TMRE peuvent aider à évaluer la phototoxicité et la santé des cellules en général 8,15. Illumination avec la lumière epifluoerescent devrait être évitée. Alors que la recherche de cellules exprimant mtPAGFP, le sténopé doit être au maximum ouvert pendant le balayage avec une excitation 488nm à faible puissance. Réglage de la puissance du laser à deux photons pour photoactiver assez PA-GFP pour mesurer le signal de plus de 1 heure, mais de ne pas saturer l'une des cellules peut être difficile 8. Cependant, le temps devrait être consacré à cette étape parce que le programme d'optimisation automatisée est une fois commencé, il est fastidieux de l'arrêter, pour choisir d'autres cellules, et de reprendre.
Pour le contrôle qualité, l'acquisition d'un contraste d'interférence différentiel (DIC) image (ou lumière transmise) pour surveiller l'accent mis sur les cellules peuvent être trèsutile et aussi un bon moyen pour détecter les bulles formées dans l'huile d'immersion lors de la numérisation, ce qui arrive parfois à partir des mouvements de la scène.
Bien que l'utilisation de cette méthode mtPAGFP recueille des données sur le mouvement unidirectionnel de protéines de la matrice des mitochondries de mitochondries photoactivé à ceux qui ne sont pas étiquetés, il est concevable d'utiliser cette technique pour étudier les processus d'autres. Par exemple, fluorochromes spécifiques peuvent être fixés à des protéines membranaires d'observer leur mouvement spécifique lors d'événements de fusion, comme cela a été montré pour ABC-moi, la fusion de ce qui se produit sur une échelle de temps différente du mélange de protéines de la matrice solubles 15.
Disclosures
La production et l'accès gratuit à cet article est sponsorisé par Zeiss, Inc
Acknowledgments
Nous remercions le Centre Tufts pour la recherche en neurosciences, P30 NS047243 (Jackson), les mitochondries de la recherche collaborative d'affinité (mtARC) soutenu par le Centre pour la recherche biomédicale Evans interdisciplinaire à l'Université de Boston Campus médical, médecine Société Lien, et Zeiss pour soutenir ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Dr. Lippincott-Schwartz | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
- Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
- Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
- Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
- Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
- Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
- Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
- Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
- Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
- Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
- Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
- Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100 (2011).
- Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
- Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
- Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
- Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
- Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
- Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).
