Der schnellere, Hohe Auflösung, MTPA-GFP-basierte Mitochondriale Fusion Assay Acquiring Kinetische Daten mehrerer Zellen parallel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie

Summary

Mitochondrien-Fusion wurde durch das Verfolgen der Äquilibrierung von photokonvertiertem Matrix-bezogenen GFP über die mitochondriale Netzes über die Zeit gemessen. Bisher konnte nur eine Zelle zu einer Stunde lange kinetische Analyse bei einer Zeit unterworfen werden. Wir präsentieren eine Methode, die misst gleichzeitig mehrere Zellen und beschleunigt so den Prozess der Datensammlung.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Image Plate Vorbereitung Kultur INS1 Zellen in RPMI-Medium, enthaltend 10% fötales Rinderserum Standard, 1% Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM Brenztraubensäure und 11 mM Glucose bis 80% Konfluenz. Trypsinieren die INS1 Zellkulturen, die mit 0,05% Trypsin und Platte ihnen auf Poly-D-Lysin-beschichteten Deckglas-Boden Speicherfolien (30-40% Konfluenz). Lassen Sie für Teller 60-80% Konfluenz (~ 2 Tage) zu erreichen und fügen mitochondrialen Matrix gezielt (COXVIII) adenoviralen PA-GFP für 24 Std. (MOI = 5). Exchange-Medien und ermöglichen Zellen für weitere 2 Tage vor der Bildgebung zu wachsen. Am Tag der Bildgebung, fügen 7-15 nM TMRE zu den Speicherfolien und Gleichgewicht für mindestens 45 min. Während dieser Zeit wiederum auf dem Inkubator (Stufe oberen Inkubator wurde hier verwendet) und ermöglichen das Mikroskop auf 37 ° C für etwa 1 Stunde lang äquilibrieren. Schalten Sie die 5% CO 2. </li> 2. Bildparameter für die Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop Nach dem Mikroskop hat äquilibriert, unter der Erwerb Registerkarte auf "show Handwerkzeugen" klicken, öffnen Sie die Imaging-up-Panel eingestellt, und wählen Sie "Kanal-Modus" wechseln und verfolgen jeden "Frame". Im Lichtweg-Panel, wählen und LSM-Channel-Modus. Arbeiten von der Probe nach oben Symbol, wählen Sie "hinten", MBS-690 +, 488 und MBS. An der Unterseite des Panels, wählen Sie "T-PMT", um die Visualisierung des Hellfeld oder DIC-Kanal zu ermöglichen. Fertig zur Anpassung der Lichtweg-Parameter durch Einstellen des Bereichs für das GFP-Farbstoff 490-540 nm und 580-700 nm für die TMRE Farbstoff. In der Übernahme-Modus, verwenden Sie ein 512 × 512 Pixel Scanfeld, durchschnittlich 4x, und wählen Sie einen Zoom-Faktor (die Sie behalten möchten, für die Kalibrierung konsistent). 3. Die Optimierung der Bildparameter Mit dem Plan Achromat 100x (1,4 NA) Objektiv, focuns auf Ihre Zellen mit dem Halogenlicht, nicht fluoreszierendes Licht, zum Schutz von Phototoxizität Mitochondrien. Screen für PA-GFP exprimierenden Zellen mit einer maximal geöffneten Lochkamera und Scannen, um die Zellen, die heller grün zu finden. Finden Sie die niedrigsten Macht der 2-Photonen-Laser benötigt, um die PA-GFP aktivieren und optimieren die Bildparameter sicherzustellen, dass das Signal nicht in die Sättigung des Detektors. Sicherstellen, dass die PA-GFP-Signal mit dem TMRE Signal für ein paar Z-Serie kolokalisiert. Der Verlust des TMRE Signal zeigt an mitochondrialen Depolarisation oder Phototoxizität, und Zellen, die eine diese Eigenschaften sollten nicht für die Analyse verwendet werden. Finden Sie eine PA-GFP exprimierenden Zelle und geben Sie einen Zoom-Faktor. Stellen Sie die Z-Serie Bereich bis 6 Scheiben (dieser Bereich benötigen, um alle 10 Zellen zu befriedigen, wenn ein eigenes z-Fokus an jeder Position gesetzt ist) zu sammeln. Speichern der Bildgebungsverfahren für jede Zelle (Zelle 1, Zelle 2 usw.). 4. Passen Sie die Automated Teil des Programms und benennt die 10 Zellen, die Sie für die 1 Stunde Mitochondriale Fusion Assay folgen wird Auf der linken Seite des MultiTime Wählen Sie im Fenster "Speichern"-Panel, und geben Sie den Ort, wo Dateien gespeichert werden sollen. In der "Übernahme"-Panel, laden Sie die Erwerbsmethode für Zelle 1 in der Scan-Konfiguration gespeichert und überprüfen Sie die Z-Stapel-Box. Auch die Option "gekennzeichneten Z-Mitte z-Stapel". In der "Blöcke" Systemsteuerung, wählen Sie "Single Block an jedem Standort". Klicken Sie auf "Add Blöcke" für jedes Intervall gemessen werden soll. In der "Timing"-Panel, wählen Sie "warten Intervall" und geben Sie "0" in der "Wartezeit einhalten, bevor er auf den ersten Block Lage nur." Die Blöcke 2-4 wird "15 Minuten" in diesem Abschnitt. In der Lage-Panel, wählen Sie "Verschieben des Fokus auf Position zwischen den Standorten zu laden" und "Last Config oder zu scannen, wenn Sie auf 'Weiter loc' geklickt 'to loc bewegen". Unter dem "edit Standorten Liste" wählen Sie "Alle löschen" und wählen Sie dann "multiple Standorten Motortisch ". UndER der "Bleach"-Panel, klicken Sie auf die "Bleiche" ein, und benennen Sie die Konfigurationsdatei in der "config" im Pulldown-Menü, wie in dem Fenster der Haupt-Software bezeichnet. Dann, in der "Bleichen" Fenster, speichern Sie die entsprechende Methode Photoaktivierung. In den Regionen Panel, wählen Sie den ROI für diese spezielle Zelle, und stell 'das ROI der MultiTime durch Auswahl von "Add die Region auf die ROI-Liste"-Fenster. Achten Sie darauf, um die gleiche Stelle in der "ROI" wählen Sie im Pulldown-Menü. Für das Timing richtig funktioniert und für jede Zelle, um eine 15 Minuten-Intervall haben, müssen zwei Methoden, um gerettet zu werden. In der Liste der Blöcke, wird der erste, der die "echte" Photoaktivierung Konfiguration, und der Rest wird eine "Mock"-Konfiguration, die nicht nutzt die Zwei-Photonen-Laser haben. Der erste Block wird auch der einzige Block, der nicht über eine Verzögerung (BKIntv = 0) sein. Daher beginnt das Verfahren mit einer Baseline-Scan, mit einem Photoaktivierung Scan folgt. Der Rest der Blöcke haben eine 900 sec BkIntv, undzu jedem Zeitpunkt gibt es zwei Scans wie zum Zeitpunkt 0 s, um das Timing Konsistenz zu erhalten. Für jede der 10 Zellen im Laufe der Zeit verfolgt werden, führen diese Reihenfolge: Finden Sie eine paGFP-exprimierende Zelle speichern ihre bildgebenden Verfahren Location-Panel markieren die Position der Bühne, geben bildgebende Verfahren Haupt-ROI-Panel wählen Sie eine Region von Interesse sein photoaktivierte Bleach-Panel sparen spezifische ROI und laden Sie es auch in der ROI-Box: Löschen Sie den ROI und setzen Sie den Scan-Zoom bis 1 Finden Sie die nächste Zelle und stellen Sie den Zoom Wiederholen Sie den Vorgang für die nächsten 9 Zellen Überprüfen Sie, dass jede Stufe Lage und alle Blöcke die entsprechende bildgebende Verfahren (Scan-Konfiguration) zugeordnet ist. Achten Sie außerdem darauf, dass der erste Block an jedem Ort auf die entsprechende Photoaktivierung Methode entspricht, während der Rest einen "Mock"-Methode enthalten. Schließlich wählen Sie "Ausführen". 5. Analysieren Sie die PA-GFP-Signal Intensity <li> Für die Zellen, in denen die photoaktivierbare-GFP-Signal kolokalisiert mit dem roten Signal TMRE, subtrahieren Sie den Hintergrund in den paGFP Bilder (hier benutzen wir Metamorph). Dann exportieren Sie die Daten nach Excel und berechnen die durchschnittliche Intensität für Z-Stapel zu jedem Zeitpunkt. Entsorgen optische Schnitte, die kein Signal haben. Messen Sie das Signal Verdünnung in jedem Z-Stapel durch Berechnung des Prozentsatzes der ursprünglichen photoaktivierte Signal. Jeder Datenpunkt abgetastet und aufgezeichnet zweimal, wodurch der doppelte Z-Stapel-Informationen für jeden Zeitpunkt. Prüfen, ob die Z-Stapel-Werte stimmen. Wenn nicht, ist dies für ein Problem (zB Fokus-, Zell-Bewegung). 6. Repräsentative Ergebnisse Wenn ein Ereignis Fusionsprotein zwischen einem aktivierten und nicht aktivierten PA-GFP Mitochondrium auftritt, mischt sich das paGFP in der mitochondrialen Matrix mit dem nicht-markierten Matrix und wird verdünnt über einen größeren Bereich, verringert das SignalIntensität (Abbildung 1A). In der Zelle INS1, tritt eine signifikante Abnahme der Signalintensität alle 15 Minuten, bis Äquilibrierung der mitochondrialen Fusion erreicht ist (etwa 1 Stunde). Beachten Sie, dass die Zelle in 1B nahezu vollständige Co-Lokalisation von PA-GFP und TMRE Signale aufweist. In diesen Tests eine sehr niedrige Konzentration von TMRE (15 nm) wird verwendet, um gezielt helfen, die Photoaktivierung von paGFP, und auch zu Zelle Gesundheit zu überwachen. Zellen mit einer Fülle von depolarisiert Mitochondrien haben unvollständige Kolokalisation von paGFP und TMRE und sollte nicht analysiert werden, da dies zeigt entweder Phototoxizität, oder Zellen in einem sterbenden Staat. Die Äquilibrierung für mitochondriale Fusion ist in der Regel für 1 Stunde in INS1 Zellen, wenn etwa 15% des mitochondrialen Volume aktiviert. Manchmal, auch wenn ein kleiner Bereich beleuchtet wird, werden die meisten Mitochondrien photoaktiviert aufgrund wobei stark vernetzt, wobei weitere Fusion ist schwer zu erkennen. Andere Zelltypen weisen unterschiedliche Zeiten für die Gleichgewichtseinstellung und sollten in kürzeren Abständen und über einen längeren Zeitraum getestet werden, um mitochondriale Dynamik zu charakterisieren. Um mitochondrialen Fusion inhibieren, können Zellen aus dem lipotoxische angeordnet zu werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass 0,4 mM Fragmente Mitochondrien-Palmitat, und hemmt mitochondrialen Fusion 9. Dieser Effekt kann in 2, wo Mitochondrien führen gesehen werden, aber die Signalintensität des mtPAGFP nicht so viel wie unter normalen Bedingungen ändern (1). Daher ist die Verdünnung des PA-GFP-Signal dürfte darauf zurückzuführen sein, mitochondriale Fusion statt Kernspaltung. In anderen Zelltypen, empfehlen wir die Verwendung von anderen bekannten Möglichkeiten, um mitochondriale Fragmentierung induzieren, wie zum Schweigen OPA1, die für mitochondriale Fusion 14 ist. Abbildung 1. </strong> Typische Verdünnung des PA-GFP-Signal nach der Photoaktivierung während eines mitochondrialen Fusion Assay. A. PA-GFP wird zunehmend dunkler durch mitochondriale Fusion Ereignisse, die zur Verdünnung des Proteins über eine zunehmende Fläche, wie in diesen projizierten Bildern zu sehen ist von 6 optische Schnitte alle 15 Minuten quantifiziert. B. TMRE mit PA-GFP zeigt, dass die Mitochondrien aktiv und nicht depolarisiert sind. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 2. Mitochondriale Fusion mit 0,4 mM Palmitat gehemmt verringert die Verdünnung des PA-GFP. A. Projektionen von 6 optische Schnitte zeigen kurze Mitochondrien mit einer unveränderlichen Signalintensität über die Zeit. B. Kolokalisation von PA-GFP mit TMRE zeigt, dass die Mitochondrien sind nicht depolarisiert. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

Dieses Verfahren ermöglicht die Abbildung von etwa 10 Zellen zu einem Zeitpunkt, wenn die Beschaffung tritt alle 15 Minuten nach der Photoaktivierung. Die genaue Anzahl der Zellen wird davon abhängen, wie schnell man in der Lage zu lokalisieren und markieren Sie die mtPAGFP exprimierenden Zellen in der Kulturschale, und wie schnell kann man einrichten alle Software-Parameter ist. Um die Automatisierung reibungslos eine gleichmäßige Schicht von Zellen zu verwenden, weil die benannten Z-Stapel-Margen für alle Zellen anwenden wird.

Die Größe dieses ersten Photoaktivierung Bereich regeln die Wartezeit. Um mitochondrialen Fusion messen, ist es wichtig, dass nur 10-20% des Netzes, so dass die Ausbreitung des Signals mit dem Rest des Netzes über die Zeit überwacht werden kann photoaktivieren. Wenn zu viel des Netzes wird photoaktiviert, ist es möglich, dass eine vollständige Fusion zu schnell kommen, und das Ereignis wird nicht erfasst werden.

Äußerste Sorgfalt muss darauf geachtet werdenEinstellung der Laserleistung von der Zwei-Photonen-Laser sowie die Konzentration auf TMRE Phototoxizität die mitochondriale Depolarisation führt zu vermeiden. Sicherstellen, dass das Signal mit dem mtPAGFP TMRE Signal kolokalisiert kann bei der Beurteilung der Phototoxizität und allgemeine Gesundheit Zelle ^8,15 zu helfen. Beleuchtung mit Licht epifluoerescent sollte vermieden werden. Auf der Suche nach Zellen, die mtPAGFP, sollte das Loch sein, maximal geöffneten beim Scannen mit einem Low-Power 488nm Anregung. Einstellen der Zwei-Photonen-Laser-Leistung zu photoaktivieren genug PA-GFP, um das Signal über 1 Stunde messen, aber nicht zu übersättigen eine der Zellen kann tückisch sein ^8. Allerdings Mal in diesem Schritt der Optimierung ausgegeben werden sollte, denn wenn automatisiertes Programm gestartet wird, ist es mühsam, ihn zu stoppen, um mehr Zellen zu wählen, und wieder aufzunehmen.

Für die Qualitätskontrolle, Akquisition eines Differential Interferenz Kontrast (DIC) Bild (oder Durchlicht), um den Fokus auf die Zellen überwachen kann sehr seinhilfreich und auch ein guter Weg, um Luftblasen im Immersionsöl während des Scannens gebildet zu erkennen; dies geschieht manchmal aus den Bewegungen der Bühne.

Obwohl mit diesen Verfahren mtPAGFP sammelt Daten über die unidirektionale Bewegung der mitochondrialen Matrix Proteine ​​aus photoaktiviert Mitochondrien diejenigen, die nicht markiert sind, ist es denkbar, diese Technik auf andere Prozesse zu studieren nutzen. Zum Beispiel können bestimmte Fluorochrome, Membranproteine ​​angebracht werden, um ihre spezifischen Bewegung während der Fusion Ereignisse zu beobachten, wie es für ABC-me, die Fusion von denen auf einer anderen Zeitskala aus dem Mischen von löslichen Matrixproteine ^​​15 tritt gezeigt worden.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss