מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Summary

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. פלייט תמונה הכנה INS1 התרבות התאים RPMI התקשורת המכילים 10% תקן בסרום שור עוברית, 1% לפניצילין, סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 5 מ"מ NaHCO 3, 2 HEPES מ"מ, חומצה pyruvic 2 מ"מ, ו 11 גלוקוז mM עד המפגש 80%. Trypsinize את בתרביות תאים INS1 עם טריפסין 0.05% ואת צלחת אותם על פולי-D-ליזין coverslip קרקעית צלחות מצופה הדמיה (מפגש 30-40%). לאפשר צלחות להגיע מפגש 60-80% (~ 2 ימים) ולהוסיף מטריקס המיטוכונדריה ממוקד (COXVIII) adenoviral PA-GFP של 24 שעות (משרד הפנים = 5). שערי המדיה המאפשרים לתאים לגדול עוד 2 ימים לפני הדמיה. ביום הדמיה, להוסיף 7-15 TMRE nM ללוחות הדמיה, וכן לאזן דקות לפחות 45. במהלך סיבוב הפעם חממה (השלב ​​העליון החממה נעשה שימוש כאן) ולאפשר מיקרוסקופ כדי לאזן ל 37 מעלות צלזיוס במשך שעה בערך 1. הפעל CO 5% 2. </li> 2. הדמיה פרמטרים של מיקרוסקופ LSM 710 Zeiss Confocal לאחר מיקרוסקופ יש equilibrated, בכרטיסייה רכישה, לחץ על "כלים להראות ידני", פתח הדמיה להקים הפאנל, ובחר "מצב הערוץ" ולעבור לעקוב אחר כל "מסגרת". בלוח נתיב האור, בחר LSM מצב הערוץ. עבודה מסמל את הדגימה כלפי מעלה, בחר "אחוריים", MBS 690 +, ו-MBS 488. בחלק התחתון של הפאנל, בחר "T-PMT" כדי לאפשר הדמיה של שדה בהיר או ערוץ DIC. סיום התאמת פרמטרים נתיב האור על ידי הגדרת טווח עבור צבע GFP כדי 490-540 ננומטר ל 580-700 ננומטר עבור צבע TMRE. במצב הרכישה, השתמש 512 × 512 פיקסלים סריקה שדה, 4x הממוצע, ולבחור גורם הזום (אשר מומלץ לשמור על עקביות לצורך כיול). 3. אופטימיזציה של פרמטרים הדמיה באמצעות תוכנית apochromat 100x (1.4 NA) העדשה אובייקטיבי, focלנו התאים באור הלוגן, לא אור ניאון, כדי להגן על המיטוכונדריה של phototoxicity. מסך PA-GFP להביע תאים באמצעות חריר פתוח מקסימאלי וסריקה למצוא את התאים שנמצאים ירוק בהיר יותר. מצא את ההספק הנמוכה ביותר של לייזר 2-פוטון צריך להפעיל את PA-GFP לייעל את הפרמטרים הדמיה להבטיח כי האות לא להרוות את הגלאי. בדוק את האות PA-GFP colocalizes עם האות TMRE עבור כמה Z-Series. איבוד אות TMRE מציין שלילת קוטביות phototoxicity המיטוכונדריאלי, או, ותאי מציג מאפיינים אלה לא אמור לשמש לניתוח. מצא את התא PA-GFP להביע ולציין גורם הזום. הגדר את טווח Z-Series לאסוף 6 פרוסות (טווח זה צריך לספק את כל 10 תאים מסוים, אלא אם כן Z-להתמקד נקבע כל עמדה). שמור את שיטת הדמיה עבור כל תא (תא 1, תא 2 וכו '). 4. התאם את אוטומציהפרשת ד 'של התוכנית וציין את 10 תאים האם תבואי עבור Assay 1 התוך מיטוכונדריאלי שעה אחת בפאנל השמאלי של חלון multitime, בחר את לוח "חיסכון", וציין את המיקום שבו הקבצים יישמרו. בלוח "רכישה", טען את שיטת הרכישה הציל לתא 1 בתצורת סריקה, וסמן את התיבה מחסנית z. גם לבחור "סימנה Z הבינוני של מחסנית Z". בלוח "בלוקים", בחר "בלוק אחד במקום אחד". לחץ על "בלוקים להוסיף" עבור מרווח זה כדי להימדד. בלוח "העיתוי", בחר "להמתין מרווח" והקלד "0" ב "מרווח ההמתנה לפני בלוק במקום הראשון בלבד". אבני 2-4 יהיה "15 דקות" בסעיף זה. בלוח הודעות, בחר "להעביר את המוקד לטעון עמדה בין מקומות" ו "עומס לסרוק config כאשר" לעבור לוק 'או' הבא loc "לחיצה. תחת" רשימת מקומות ערוך "בחר" לנקות את כל "ולאחר מכן לבחור" מספר רב של מקומות ממונע הבמה ". Undאה פאנל "Bleach", לחץ על התיבה "אקונומיקה", וציין את קובץ ההגדרות של "config" לנתץ התפריט, יועד בחלון הראשי של התוכנה. לאחר מכן, בחלון "הלבנה", שמור את השיטה photoactivation המתאים. בלוח אזורים, בחר את ההחזר על ההשקעה עבור תא מסוים, ולהוסיף את ההחזר על ההשקעה על מנת multitime על ידי בחירת "האזור הנוכחי להוסיף לרשימה את ההחזר על ההשקעה" חלון. הקפד לבחור את המיקום אותו "החזר השקעה" לנתץ התפריט. לעיתוי לעבוד כראוי עבור כל תא יש מרווח 15 דקות, שתי שיטות צריך להישמר. ברשימת בלוקים, הראשון יהיה בתצורת "אמיתי" photoactivation, והשאר יהיו בתצורת "מדומה" שאינו עושה שימוש בלייזר שני הפוטונים. בלוק 1 יהיה גם לחסום רק שאין עיכוב (BKIntv = 0). לכן, השיטה מתחילה סריקה 1 הבסיס, ולאחר מכן סריקה photoactivation. שאר הבלוקים יש 900 שניות BkIntv, ובכל נקודת זמן יש שתי סריקות בדיוק כמו בכל פעם 0 שניות בלבד, כדי לשמור על עקביות העיתוי. עבור כל אחד 10 תאים להיות שלאחר לאורך זמן, לבצע את הרצף: מצא PAGFP להביע תאים לשמירת שיטת ההדמיה שלה מיקום לוח-לסמן את מיקום הבמה, ציין שיטת הדמיה ראשי לוח-ROI לבחור אזור של אינטרס להיות בליץ photoactivated לוח-להציל את ההחזר על ההשקעה ספציפי גם לטעון אותו בתיבה ההחזר על ההשקעה: למחוק את ההחזר על ההשקעה ולאפס זום סריקה עד 1 מצא את התא הבא להגדיר את הזום חזור על התהליך עבור 9 תאים הבאות בדוק כי כל מיקום הבמה את כל הלבנים יש את שיטת הדמיה המתאים (סריקה תצורה) קשורים. כמו כן לוודא כי בלוק 1 במיקום זה מתאים לשיטה photoactivation המתאים ואילו השאר מכילים שיטת "מדומה". לבסוף, בחר באפשרות "הפעל". 5. לנתח את עוצמת PA-GFP אותות <lאני> כי התאים שבהם האות photoactivatable-GFP colocalizes עם האות TMRE אדום, לחסר רקע התמונות PAGFP (כאן אנו משתמשים metamorph). ואז לייצא את הנתונים ל-Excel ולחשב את עוצמת הממוצע של Z-ערימות בכל נקודת זמן. מחק חלקים אופטיים שאין להם האות. למדוד את דילול האות בערימה-Z זה על ידי חישוב אחוז האות photoactivated המקורי. כל נקודת נתונים נסרק והקליט פעמיים, וכתוצאה מכך המידע Z-מחסנית כפול עבור כל נקודה בזמן. בדוק את Z-מחסנית ערכים מסכים. אם לא, זה מעיד על בעיה (למשל, מוקד התנועה התא). 6. נציג תוצאות כאשר האירוע מתרחש היתוך בין פעיל ולא פעיל PA-GFP mitochondrion, PAGFP בתוך המטריקס המיטוכונדריאלי מתערבב עם המטריצה ​​הלא מסומן הופך מדולל על פני שטח גדול יותר, ולהקטין את האותעוצמת (איור 1 א). בתא INS1, ירידה משמעותית בעוצמת האות מתרחשת כל 15 דקות, עד איזון של היתוך המיטוכונדריה הושג (כ 1 שעה). ראוי לציין, כי תא איור 1B מציג colocalization כמעט שלם של PA-GFP אותות TMRE. ב מבחני אלה ריכוז נמוך מאוד של TMRE (15 ננומטר) משמש כדי לסייע למקד photoactivation של PAGFP, וגם כדי לפקח על בריאות התא. תאים עם שפע של המיטוכונדריה depolarized יהיה colocalization שלם של PAGFP ו TMRE ולא יש לנתח כי זה מציינת phototoxicity או תאים במצב גוסס. זמן איזון היתוך המיטוכונדריה הוא בדרך כלל 1 שעות ב INS1 תאים, כאשר ~ 15% של נפח המיטוכונדריה מופעל. לפעמים, גם אם שטח קטן מואר, רוב המיטוכונדריה להיות photoactivated בשל היותו ברשת מאוד, ובמקרה זה היתוך נוספת קשה לזהות. סוגי תאים אחרים עשויים להפגין פעמים איזון שונים יש לבדוק במרווחי זמן קצרים יותר על פני תקופה ארוכה יותר כדי לאפיין את הדינמיקה המיטוכונדריה. כדי לעכב את היתוך המיטוכונדריה, תאים יכולים להיות ממוקמים בתוך סביבה lipotoxic. זה בעבר הראו כי 0.4 מ"מ palmitate שברי המיטוכונדריה, ומעכב היתוך המיטוכונדריה 9. השפעה זו ניתן לראות באיור 2, שבו המיטוכונדריה הם מקוטעת, אך את עוצמת האות של mtPAGFP לא משנה עד כמה בתנאים רגילים (איור 1). לפיכך, דילול של אות PA-GFP הוא ככל הנראה עקב היתוך המיטוכונדריה ולא ביקוע. ב סוגי תאים אחרים, מומלץ להשתמש בדרכים ידועות אחרות כדי להשרות הפיצול המיטוכונדריה, כגון להשתיק OPA1 אשר הכרחי היתוך המיטוכונדריה 14. באיור 1. </strong> דילול אופיינית של אות PA-GFP לאחר photoactivation במהלך assay היתוך המיטוכונדריה. א PA-GFP הופך בהדרגה דימר בשל תופעות היתוך המיטוכונדריה המובילים דילול של החלבון על פני שטח גדל והולך כמו שניתן לראות את התמונות המוקרנות 6 חלקים אופטיים לכמת כל 15 דקות. ב TMRE עם PA-GFP מראה כי המיטוכונדריה פועלים ולא depolarized. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה . איור 2. היתוך מיטוכונדריאלי עכבות עם palmitate 0.4 מ"מ מפחית את דילול של PA-GFP. תחזיות א של 6 חלקים אופטיים מראה המיטוכונדריה קצר עם עוצמת האות משתנה עם הזמן. Colocalization ב 'של PA-GFP עם TMRE המיטוכונדריה מראה כי הם לא דהמקוטב. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

שיטה זו מאפשרת הדמיה של כ 10 תאים בכל פעם, אם הרכישה מתרחשת כל 15 דקות לאחר photoactivation. מספרם המדויק של תאים יהיה תלוי כמה מהר 1 הוא מסוגל לאתר ולסמן את התאים המבטאים mtPAGFP בתוך צלחת התרבות, וכמה מהר אפשר להגדיר את כל הפרמטרים תוכנה. כדי לבצע אוטומציה לפעול בצורה חלקה גם שכבת התאים יש להשתמש משום המיועדים Z-מחסנית שולי יחולו על כל התאים.

גודלו של אזור זה photoactivation הראשונית תנחה את הזמן איזון. כדי להיות מסוגלים למדוד היתוך המיטוכונדריה, חשוב photoactivate רק 10-20% של הרשת, כך התפשטות האות לשאר הרשת ניתן לפקח לאורך זמן. אם יותר מדי של הרשת הוא photoactivated, יתכן איחוי מלאה תתרחש מהר מדי, האירוע לא ליפול בפח.

במשנה זהירות יש לנקוטלהתאים את כוח לייזר לייזר של שני הפוטונים, כמו גם ריכוז TMRE להימנע phototoxicity שמוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה. להבטיח את האות mtPAGFP colocalizes עם האות TMRE יכול לעזור בהערכת phototoxicity ובריאות כללית תא ^8,15. תאורה באור epifluoerescent יש להימנע. במהלך חיפוש בתאים המבטאים mtPAGFP, חריר צריך להיות פתוח מקסימאלי תוך סריקה באמצעות עירור צריכת חשמל נמוכה 488nm. התאמת כוח שני פוטונים לייזר photoactivate מספיק PA-GFP כדי למדוד את האות יותר משעה 1 אך לא oversaturate כל התאים יכול להיות מסובך ^8. עם זאת, הפעם יש בילה בשלב זה אופטימיזציה, כי תוכנית אוטומטית פעם אחת הוא התחיל, זה מייגע לעצור את זה, לבחור תאים נוספים, וכן לחדש.

עבור בקרת איכות, רכישת בניגוד ההפרש התערבות (DIC) תמונה (או אור מסור) כדי לפקח על התמקדות התאים יכול להיות מאודמועיל גם דרך טובה לזהות בועות שנוצרו בשמן טבילה במהלך הסריקה, זה קורה לפעמים בין התנועות של הבמה.

אמנם בשיטה זו mtPAGFP אוסף נתונים על תנועה חד כיווני של חלבונים מטריקס המיטוכונדריה של המיטוכונדריה photoactivated לאלה שאינם מסומנים, מתקבל על הדעת להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד תהליכים אחרים. לדוגמה, fluorochromes מסוימים ניתן לחבר חלבונים בממברנה לצפות התנועה הספציפי שלהם במהלך האירועים היתוך, כפי שהוכח על ABC-ME, שילוב של המתרחש על הזמן בקנה מידה שונה ערבוב של חלבונים מסיסים מטריקס ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss