Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Summary

Wir beschreiben eine Strategie zur Reifung und Migration der pulmonalen dendritischen Zellen als Reaktion auf Ovalbumin in der Einstellung von Eieralbumin allergischen Entzündung der Atemwege zu überwachen. Diese Strategie kann modifiziert werden, um die Migration der pulmonalen dendritischen Zellen in den Einstellungen der Infektion herangezogen werden.

Abstract

Dendritische Zellen (DCs) sind die Hauptakteure bei der Initiation der adaptiven Immunantwort durch Aktivierung Antigen-spezifischen T-Zellen beteiligt. DCs vorhanden sind, in den peripheren Geweben im eingeschwungenen Zustand, aber als Reaktion auf Antigen-Stimulation, nehmen DCs das Antigen und wandern schnell zu den Lymphknoten, wo sie initiieren T-Zell-Antwort gegen das Antigen ^1,2. Zusätzlich DCs spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Initiierung Autoimmun sowie allergische Immunantwort ^3.

DCs spielen eine wesentliche Rolle sowohl in der Initiierung der Immunantwort und die Induktion einer Toleranz in der Einstellung der Lunge Umwelt ^4. Lung Umgebung weitgehend tolerogene aufgrund der Exposition gegenüber Vielzahl von Umweltantigene ^5. Doch bei einigen Personen gibt es eine Pause in der Toleranz, die zur Induktion von Allergien und Asthma führt. In dieser Studie beschreiben wir eine Strategie, die zur Reifung und Atemwege DC MIG überwacht werden könnenRation in Reaktion auf das Antigen zur Sensibilisierung verwendet. Die Messung der Atemwege Reifung und Migration ermöglicht die Beurteilung der Kinetik der Immunantwort bei allergischen Entzündung der Atemwege und hilft beim Verständnis der Größe der nachfolgende Immunreaktion zusammen mit den zugrunde liegenden Mechanismen.

Unsere Strategie basiert auf der Verwendung von Ovalbumin als Sensibilisierungsmittel bezogen. Ovalbumin-allergischen Asthma ist eine weit verbreitete Modell, um die Lungeneosinophilie, Lungenentzündung und erhöhte IgE-Spiegel bei Asthma ^6,7 vor reproduzieren. Nach Sensibilisierung werden die Mäuse durch intranasale Verabreichung von FITC-markierten Ovalbumin, die zur spezifischen Markierung von Atemwegs-DCs, welche die Aufnahme ermöglicht Ovalbumin herausgefordert. Als nächstes mit mehreren DC-spezifische Marker, können wir beurteilen, die Reifung der DC und kann auch beurteilen, ihre Wanderung zu den Lymphknoten durch den Einsatz der Durchflusszytometrie.

Protocol

1. Sensibilisierung von Mäusen mit Ovalbumin

1. Bereiten Sie eine Lösung von OVA (Grad V, Sigma, MO) in sterilem PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml (Lösung kann bei -80 ° C gelagert werden).
2. Um OVA-Alaun Mischung herzustellen, um Alaun in einem Gefäß und fügen OVA-Lösung in einem tropfenweise unter Vortexen des Rohrs bei einem Verhältnis von 1:1. Rühren Sie die Mischung für 30 Minuten und sofort nutzen nach dem Mischen.
3. Verwendung einer 1 ml Spritze, Injektion 0,2 ml der Mischung in Maus-Peritonealhöhle und wiederholen Sie die Einspritzung wieder nach 2 Wochen.

2. Intranasalen Challenge of Mäuse mit FITC markiert Ovalbumin

1. 7 Tage nach der zweiten Injektion von OVA-Alaun sind Mäuse abgebildet intranasal mit OVA-FITC in Frage gestellt werden.
2. Eine Lösung aus OVA-FITC (Sigma) unter Verwendung steriler PBS in einer Konzentration von 1 mg / ml aliquotiert und bei -80 ° C
3. Mit einem sterilen Gaze an der Unterseite eines 50 ml Falcon-Röhrchen und in einem chemischen hOOD, 5 ml Isofluran auf die Gaze. Um Mäuse betäuben, richten Sie das Tier in die Röhre für etwa 5-10 Sekunden.
4. Halten Sie den narkotisierten Tier in aufrechter Position und mit sterilen Pipettenspitzen, Pipette 100 ul der OVA-FITC-Lösung auf der Nase von Mäusen in einer tropfenweise Mode.
5. Wiederholen Sie die intranasale Provokation mit OVA-FITC für die nächsten zwei Tage.

3. Erstellung von Einzel-Zell-Suspension aus der Lunge und den Lymphknoten

1. Opfere die Mäuse mit intraperitonealen Injektion von Euthanyl.
2. Um Makrophagen-Kontamination, die DC-Analyse erschweren können zu reduzieren, wird Lungenlavage durchgeführt. Um die Lungen zu spülen, werden Maus Luftröhren kurz belichtet und mit einem Katheter und einer Spritze durchbohrt; mit eiskaltem PBS mit 5 mM EDTA, der unteren Atemwege wird 3-mal gespült, um Zellen aus den alveolären Bereiche zu entfernen.
3. Versorgen die Lungen mit 10 ml PBS, enthaltend 10 U / ml Hepardie über den rechten Ventrikel des Herzens, um Blutzellen aus der Lungengefäße zu entfernen. Führen Sie die Infusionen, bis die Lungen weiß, was auf Entfernung des größten Teils der Blutzellen verwandeln. Dies ist besonders wichtig, um kontaminierende Zellen aus dem peripheren Blut zu entfernen.
4. Sezieren die Lunge heraus und entfernen Sie mediastinalen Lymphknoten (MLN) und platzieren Sie die Lymphknoten in einer separaten Schüssel. (Versuchen Sie, um die Exposition der Gewebe zum Vorschein zu Quenching der Fluoreszenz zu verhindern, zu minimieren.)
5. Legen Sie die Lungen auf einer Petrischale und Hackfleisch mit einer Schere. Nächste verdauen die Lunge für 25 Minuten bei 37 ° C unter Verwendung von 250 U / ml Kollagenase D (Roche) und fügen EDTA (10 mM Endkonzentration) für die nächsten 5 Minuten, um Kollagenase-Aktivität zu stoppen.
6. Führen Sie die Fragmente verdaut Lunge durch ein 100 um Sieb Zelle und führen hypotone Lyse an Erythrozyten zu entfernen. Die einzigen Zellsuspension ist bereit für die weitere Analyse der DCs.
7. Um einzelne Zellsuspension aus der MLN, t vorbereitenerleichtern den MLN mit feinen Nadeln und Verdau mit Kollagenase wie oben beschrieben, gefolgt von Pressen durch ein Sieb Zelle.

4. Die Färbung für DC-Marker zur Reifung / Migration Beurteilen

1. Um DCs in der Lunge zu erkennen, ist Färbung für CD11c und CD11b durchgeführt. Außerdem, für Reifung zu beurteilen, ist Färbung für CD86 und CD80, die hochreguliert als DCs Reifung unterzogen werden durchgeführt. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^+-Zellen in der MLN werden als pulmonale DCs die Migration von der Lunge zu den MLN als Antwort auf OVA Atemwege Herausforderung identifiziert.
2. Suspend-Zellen in einer Konzentration von 10 × 10 ⁶ Zellen / ml in FACS-Puffer (PBS mit 1% FBS und 1 mM EDTA) und Aliquot 150 ul Zellsuspension / Röhre für FACS-Färbung. Zur Identifizierung von Lungen-DCs, nach Flecken werden benötigt: Ungefärbte Kontrolle (Lung Zellen von Mäusen nicht zu OVA-FITC ausgesetzt), OVA-FITC-Kontrolle, CD11c einzige Kontrolle, CD11b einzige Kontrolle, CD11b⁺ CD11c ⁺ Doppel-Kontrolle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ doppelte Kontrolle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ doppelte Kontrolle, MHC II einzigen Kontrolle, CD86 einzige Kontrolle, CD80 einzigen Kontrolle und Proben für die OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ^{+ +} MHCII gefärbt , OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD86 ⁺ und OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD11b ⁺ CD80 ^+.
3. Um DC-Migration zu bewerten, führen absolute Zellzahlen der einzige Zellsuspension aus MLN und fertigt sodann folgende Röhren: Ungefärbte Kontrolle (MLN-Zellen von Mäusen, die nicht auf OVA-FITC ausgesetzt), OVA-FITC-Kontrolle, CD11c ⁺ einzigen Kontrolle, CD11b ⁺ doppelte Kontrolle, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ Doppel-Kontrolle, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ Doppel-Steuerung und CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ Proben.

5. Repräsentative Ergebnisse

Die Zeitpunkte für die intraperitoneale Sensibilisierung erforderlich ist, um Atemwege allergische Entzündung zu induzieren ist wichtig und sollte durchgeführt werden, wie in 1 dargestellt. Nach intraperitonealer Sensibilisierung und Atemwege OVA Herausforderung, die Induktion von allergischen Entzündung der Atemwege zu bestätigen, können einige Mäuse getötet und histologische Analysen auf der Lunge Abschnitten durchgeführt werden, wie in 2 gezeigt. Vorliegen von Entzündungszellen kann durch Hämatoxylin & Eosin-Färbung bestätigt werden (Abbildung 2A) und Anwesenheit von Schleim Produktion kann durch periodische-Acid-Schiff-Färbung (Abbildung 2B) beurteilt werden. Insgesamt stellt die Induktion der allergischen Entzündung der Atemwege nach OVA Herausforderung der OVA-sensibilisierten Mäusen ⁸ zu bestätigen. Im Gegensatz dazu werden Lungenschnitten von Saline behandelten Mäusen zu erwarten, dass frei von Entzündungen mit Fehlen einer Schleimbildung. Darüber hinaus folgende OVA Herausforderung, Lungen-DCs unde rgo Reifung und spätere Migration zu den Lymphknoten. Analyse der CD11c ⁺ Zellen in den Lymphknoten (MLN) aus sensibilisierten Mäusen mit OVA und herausgefordert wird erwartet, dass ein höherer Anteil der CD11c ⁺ Zellen im Vergleich zu Kochsalzlösung behandelten Mäusen (3A) zu zeigen. Außerdem Analyse der absoluten Zellzahl von CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^+-Zellen in der MLN von OVA-sensibilisierten und provozierten Mäusen, wird erwartet, zeigen eine signifikant höhere (dh um ein Mehrfaches höher) zählen, dass die Kollegen aus Kochsalzlösung behandelten Mäusen ( 3B).

1. Experimentelles Protokoll zur Induktion von Ovalbumin (OVA) induzierten allergischen Entzündung der Atemwege bei Mäusen mit Atemwege Herausforderung mit FITC-markiertem Ovalbumin (OVA-FITC).

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2. OVA Sensibilisierung durch OVA Atemwege Herausforderung gefolgt führt zur Induktion von allergischen Entzündung der Atemwege, wie identifiziert durch Hämatoxylin und Eosin-Färbung der Lunge Abschnitte (A) gezeigt, und führt auch zu Schleimproduktion in den Atemwegen, wie durch Periodsäure-Schiff-Färbung der Lunge festgestellt Abschnitte, wie in (B) gezeigt.

Abbildung 3. OVA-FITC Herausforderung induziert DC-Migration von der Lunge zu den mediastinalen Lymphknoten (MLN). (A) Durchflusszytometrie Plots darstellen Anteile von CD11c ⁺ Zellen in der Kontrolle oder der MLN OVA-sensibilisierten Mäusen. (B) Absolute Grafen von CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ^+-Zellen in der MLN auf Salz-oder OVA-sensibilisierten Mäusen. * P <0,05. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Discussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine Durchflusszytometrie basierenden Ansatz für die Analyse von Lungen-DCs, bei Lieferung von OVA-FITC zur Sicherung der Atemwege Herausforderung basiert. Dies ermöglicht eine selektive Abfrage der pulmonalen DCs, die bis zu OVA-FITC und damit die DC-Populationen, die überwacht werden, sind diejenigen, die effektiv in den Atemwegen Immunantwort beteiligt sind im Verlauf der OVA-induzierten allergischen Entzündung der Atemwege. In Kontroll-Mäusen, in Abwesenheit von allergischen Entzündung der Atemwege, sind die Zahlen der wandernden DCs (OVA-FITC + DCs) in der MLN identifiziert anzeigt Basalraten der DC-Migration, die in Reaktion auf allergische Entzündung der Atemwege was zu einer erheblichen Zunahme der Beschleunigung absolute Anzahl von OVA-FITC + DCs in der MLN. Die beschriebene Strategie bietet den Vorteil gegenüber herkömmlichen immunhistochemischen / Immunfärbung Ansätze, weil Analyse kann in kürzerer Zeitspanne durchgeführt werden und die Effizienz / Empfindlichkeit ist wesentlich höher. Daher ist es EQually wichtig sicherzustellen, dass ordnungsgemäße Kontrollen wie in den beschriebenen Methoden während der Durchflusszytometrie-Analyse eingesetzt werden. Ein weiterer Parameter, die die Ergebnisse beeinflussen kann, ist die Herstellung von Einzelzell-Suspension aus der Lunge. Daher muss darauf geachtet werden signifikante Exposition des Gewebes, um Licht für sie die Fluoreszenz von OVA-FITC und Pflege beeinträchtigen verhindern ist auch während der enzymatischen Verdau der Lunge über die Verdauung aufgenommen werden können, um die Spaltung der Oberflächenmarker auf Zellen führen, die wird Downstream-Analyse beeinflussen. Alveolarmakrophagen und DCS-Aktie ähnliche Sätze von Oberflächenmarker, das erschwert die Untersuchung der pulmonalen DC-Populationen ^9. Daher ist es entscheidend, um die Lungen zu spülen, um Alveolarmakrophagen, die mit DC-Analyse stören entfernen können.

Zusätzlich zu der Analyse der pulmonalen DC Migration während allergische Entzündung der Atemwege, kann die beschriebene Methode möglicherweise modifiziert werden, um die Immunantwort auf andere eine Beurteilungtigens, wobei spezifische Antigene, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert verteilt werden kann intranasal. Anschließend ähnliche Analysen, wie oben beschrieben durchgeführt werden kann, um pulmonale DC anspricht. In Fällen, in denen Antigen nicht beschriftet werden können, können nur wenige Stunden vor der Auslieferung Antigen, FITC-Dextran oder CFSE an Mäusen ausgeliefert werden. Anschließend, nachdem Antigenen, kann die Analyse durchgeführt werden, um Wanderung der FITC-Dextran oder CFSE markierten DCs MLN, die die Kinetik der pulmonalen DC Migration nach der Impfung mit dem spezifischen Antigen zeigen, ^10,11 überwacht werden soll. In unserer bisherigen Arbeit haben wir diese Strategie, um der Reifung / Migration der pulmonalen DCs als Antwort auf Lieferung von adenoviralen Vektoren für die Gentherapie ¹⁰ beurteilen beschäftigt. Da DCs phagozytischen, intranasale Verabreichung von FITC-Dextran führt zu einer schnellen Aufnahme durch pulmonale DCs, die dann mittels Durchflusszytometrie kontrolliert werden kann. In Fällen, in denen die Überwachung der pulmonalen plasmazytoide DCs gewünscht wird, sollte CFSE Mitar seinyed seit plasmazytoide DCs nicht tun Aufnahme FITC-Dextran so effizient wie andere pulmonale DC-Untergruppen ^10.

Insgesamt bietet die beschriebene Strategie Vorteil gegenüber herkömmlichen Ansätzen für eine quantitative Analyse der pulmonalen DC-Reifung / Migration bietet im Verlauf der Entzündung der Atemwege.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience