アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

Summary

我々は、オボアルブミン誘発アレルギー性​​気道炎症の設定でオボアルブミンに反応して肺樹​​状細胞の成熟と移行を監視するための戦略について説明します。この戦略は、感染の設定で肺樹状細胞の遊走を評価するために変更することができます。

Abstract

樹状細胞（DC）が抗原特異的T細胞を活性化することにより適応免疫応答の開始に関与する重要なプレーヤーである。 DCは、定常状態での末梢組織に存在していますが、抗原刺激に応答して、樹状細胞は、抗原を取り上げ、急速にそれらが抗原^1,2に対するT細胞応答を開始する所属リンパ節に移行します。さらに、樹状細胞はまた、自己免疫などアレルギー性免疫応答^3を開始するのに重要な役割を果たしている。

DCは、肺の環境⁴の設定に公差の免疫応答と誘導の両方の開始に重要な役割を果たしています。肺の環境では、環境抗原⁵の広大な配列への暴露により主に寛容です。ただし、一部の個体でアレルギーや喘息の誘発につながる耐性の休憩がある。本研究では、気道DCの成熟とMIGを監視するために使用することができます戦略を記述感作に用いた抗原に応答して配給。気道DCの成熟と移行の測定は、気道アレルギー性​​炎症時に免疫応答の動態の評価を可能にし、また根本的なメカニズムとともに、その後の免疫応答の大きさを理解する上で役立ちます。

我々の戦略は、増感剤としてオボアルブミンの使用に基づいています。オボアルブミン誘発性アレルギー性喘息は、気道好酸球増加、肺の炎症、喘息^6,7中に見つかった上昇IgE値を再現するために広く使われているモデルです。感作後、マウスを取り込みオボアルブミン気道樹状細胞の特異的な標識を可能にFITC標識アルブミンの鼻腔内送達によって、求められています。次に、いくつかのDC特異的なマーカーを使用して、我々はこれらの樹状細胞の成熟を評価することができ、また、フローサイトメトリーを用いることにより、所属リンパ節への移行を評価することができます。

Protocol

1。オボアルブミンとマウスの作

1. OVA（グレードV;シグマ、MO）の溶液を調製し、1 mg / mlの濃度で滅菌したPBS（溶液は-80℃で保存することができます）。
2. OVA-ミョウバン混合物を調製するためには、チューブにミョウバンを取ると1:1の割合でチューブをボルテックスしながら滴下する方法でOVAソリューションを追加します。 30分間混合物を攪拌して混合した後すぐに使用します。
3. 1 mlのシリンジを使用して、マウス腹腔内に混合物を0.2ミリリットルを注入し、2週間後に再度注入を繰り返します。

2。 FITC標識アルブミンを持つマウスの鼻腔内チャレンジ

1. 7日OVA-ミョウバンの第二の注入後、マウスはOVA-FITCを鼻腔内に挑戦する準備ができました。
2. -80℃でアリコートでは1 mg / mlと店の濃度で滅菌したPBSを使用して、OVA-FITC溶液（シグマ）℃を準備します。
3. 50mlファルコンチューブの底に、化学hの滅菌ガーゼを置くOODは、ガーゼの上にAerraneの5ミリリットルを追加します。マウスを麻酔するためには、約5〜10秒間チューブに動物を指示します。
4. 直立した状態で麻酔した動物を保持し、滅菌したピペットチップを使用して、ドロップダウン賢明な方法でマウスの鼻孔の上にOVA-FITC溶液を100μL添加します。
5. 次の二日間OVA-FITCと鼻の挑戦を繰り返します。

3。肺と所属リンパ節からの単細胞懸濁液の調製

1. Euthanylの腹腔内注射を使用してマウスを生け贄に捧げる。
2. DC解析を複雑にする可能性がマクロファージの汚染を減らすために、肺洗浄​​が行われます。肺を洗浄するには、マウス気管を簡単にカテーテルと注射器を露出し、カニューレを挿入されています。5mMのEDTAを含む氷冷PBSを使用して、下気道が肺胞腔からセルを削除するには、3回洗浄されています。
3. 10 U / mlの肝臓を含むPBS 10mlで肺を灌流心臓の右心室経由で、肺の血管から血液細胞を除去します。肺は血液細胞の大部分の除去を示す、白くなるまでperfusionsを実行します。これは、末梢血からの汚染細胞を除去することが特に重要です。
4. 肺を解剖し、縦隔リンパ節（MLN）を取り外し、別の皿のリンパ節を配置します。 （FITC蛍光の消光を防ぐために点灯する組織の露出を最小限に抑えるようにしてください。）
5. ペトリ皿に肺を置き、はさみを使用してミンチ。次の37℃で25分間、肺、消化°C、250 U / mlのコラゲナーゼD（Roche）を使用して、コラゲナーゼ活性を停止するには、次の5分間のEDTAを（10mMの最終濃度）を追加します。
6. 100μmのセルストレーナーを通して消化され、肺の断片を渡すと、赤血球を除去するために低張性溶解を実行します。単一の細胞懸濁液は、DCのさらなる分析のために準備ができています。
7. MLNから単一細胞懸濁液を調製するためには、t微細な針を使用してMLNを容易にし、セルストレーナーを通して緊張が続く上記のようにコラゲナーゼで消化する。

4。成熟/移行を評価するためのDCマーカーの染色

1. 肺の樹状細胞を識別するために、染色のCD11cおよびCD11bのために実行されます。さらに、成熟のために評価するために、染色はDCが成熟するようにアップレギュレートされるCD86とCD80に対して実行されています。のCD11c ⁺ CD11bを⁺ OVA-FITC ⁺ MLN中の細胞をOVA気道チャレンジに応答して、肺からMLNへの移行肺樹状細胞として識別されます。
2. FACS緩衝液（1％FBSおよび1mMのEDTAを含むPBS）、アリコートFACS染色のための細胞懸濁液/チューブ150μlの10×10 ⁶細胞/ mlの濃度で細胞をサスペンドします。肺樹状細胞の同定については、次の汚れは、必要とされる。染色コントロール（OVA-FITCにさらされていないマウスから肺細胞）、OVA-FITC制御、CD11cは単一の制御、CD11bを単一の制御を、CD11bを⁺のCD11c ⁺ダブル制御、CD11bを⁺ OVA-FITC ⁺二重制御は、CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ダブル制御、MHC II OVA-FITC ⁺のCD11c ⁺ CD11bを⁺ MHCIIを染色し、単一の制御、CD86、単一の制御、CD80単一のコントロールとサンプル⁺ 、OVA-FITC ⁺のCD11c ⁺ CD11bを⁺ CD86 ⁺とOVA-FITC ⁺のCD11c ⁺ CD11bを⁺ CD80 ^+。
3. 、DCの移行を評価するMLNからの単一細胞懸濁液の絶対細胞数を実行し、その後、以下のチューブを準備するには、次のCD11c染色コントロール（OVA-FITCにさらされていないマウスからのMLN細胞）、OVA-FITC制御^、+単一のコントロール、CD11bを⁺二重制御、CD11bを⁺ OVA-FITC ⁺二重制御は、CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ダブルコントロールおよびCD11c ⁺ CD11bを⁺ OVA-FITC ^+のサンプル。

5。代表的な結果

気道アレルギー性炎症を誘導するために腹腔内感作に必要な時間はポイントが重要であり、 図1に示すように実施すべきである。気道アレルギー性炎症の誘導を確認するために、腹腔内感作と気道のOVAチャレンジ後、いくつかのマウスを屠殺することができ、 図2に示すように、組織学的分析は、肺切片上で行うことができます。炎症性細胞の存在は、ヘマトキシリン·エオシン染色により確認することができる（ 図2A）と粘液産生の存在は、定期的な酸シッフ染色（ 図2B）によって評価することができる。完全にこれは、OVA感作マウス⁸のOVAチャレンジ後の気道アレルギー性炎症の誘導を確認します。対照的に、生理食塩水処置したマウスからの肺のセクションは任意の粘液産生の有無とともに、任意の炎症の自由になることが期待されている。さらに、以下のOVAチャレンジ、肺樹状細胞unde rgo成熟および所属リンパ節への後続の移行。感作とOVAでチャレンジしたマウスからの縦隔リンパ節（MLN）におけるCD11c ⁺細胞の解析は、生理食塩水で処置したマウス（ 図3A）と比較して、CD11c ⁺細胞の割合が高いを示すことが期待されています。また、OVA感作とチャレンジしたマウスのMLNにおけるのCD11c ⁺ CD11bを⁺ OVA-FITC ⁺細胞の絶対細胞数の解析は、生理食塩水処置したマウスからの対応という有意に高い（数倍高い、すなわち）のカウントを示すことが期待される（ 図3B）。

図1。FITC標識した卵白アルブミン（OVA-FITC）と気道のチャレンジと一緒にマウスにオボアルブミン（OVA）誘発されるアレルギー性気道炎症の誘導のための実験プロトコル。

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OVA気道チャレンジに続いて図2 OVA感作は、（A）に示すように、肺切片のヘマトキシリン·エオシン染色により同定などの気道アレルギー性炎症の誘導につながり、また、肺の過ヨウ素酸シッフ染色によって識別される気道の粘液産生につながる（B）に示すようにセクションを参照してください。

図3。OVA-FITCの課題は、肺からの縦隔リンパ節（MLN）にDCへの移行を誘導する。 （A）フローサイトメトリープロットはコントロールまたはOVA感作マウスのMLNにCD11c ⁺細胞の割合を描いた。 （B）生理食塩水またはOVA感作マウスのMLNでのCD11c ⁺ CD11bを⁺ OVA-FITC ⁺細胞^の絶対数。 * P <0.05。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

ここで紹介する方法は、気道チャレンジOVA-FITCの配信に基づいて、肺樹状細胞を分析するためのフローサイトメトリーベースのアプローチを提供しています。これは、OVA-FITCを取ると、監視されているので、DC集団は、実質的にOVA誘発性アレルギー性​​気道炎症の過程で気道免疫応答に参加しているものである肺樹状細胞の選択的な監視が可能になります。コントロールマウスでは、アレルギー性​​気道炎症の非存在下で、MLNで識別された渡り鳥のDCの番号（OVA-FITC +樹状細胞）が大幅に増加、その結果アレルギー性​​気道炎症に反応して加速DC移行の基礎率の指標であるMLNにおけるOVA-FITC +樹状細胞の絶対数。分析は、より短い時間スパンで行われ、効率性/感度がはるかに大きいことができるので、説明する戦略は、従来の免疫染色/免疫ベースのアプローチ上の利点を提供しています。したがって、eであるの方法で説明したように、適切なコントロールは、フローサイトメトリー分析の際に採用されていることを保証するためにqually重要である。結果に影響を与えることができるもう一つのパラメータには、肺からの単一細胞懸濁液の調製である。したがって、ケアは、細胞の表面マーカーの切断につながる可能性があり消化以上にわたり、それはまた、肺の酵素消化中に撮影しなければならないOVA-FITCとケアの蛍光に影響を与える可能性のために点灯する組織の重要な露出を防ぐために取られなければなりません下流の分析に影響を与えます。肺胞マクロファージと樹状細胞はさらに肺のDC集団⁹の分析を複雑に表面マーカー、同様のセットを共有しています。したがって、DC解析を妨げる可能性が肺胞マクロファージを除去するために肺を洗浄することが重要です。

アレルギー性​​気道炎症時の肺のDC移行の分析に加えて、説明した方法論が潜在的に他の免疫応答を評価するために変更することができます特定の抗原が蛍光色素で標識し、鼻腔内に配信することができるtigens、。続いて上記と同様の分析は、肺のDC応答を評価するために実施することができる。抗原送達前に抗原を標識することができない場合、数時間で、FITC-デキストランまたはCFSEは、マウスに配信することができます。その後、抗原送達した後、分析はFITC-デキストランまたは特定の抗原^10,11の接種後に肺のDC移行の速度を示しますMLNにDCを標識したCFSEの移行を監視するために実施することができる。私たちの以前の研究では、アデノウイルス遺伝子治療ベクター¹⁰の配信に対応して肺樹状細胞の成熟化/移行を評価するために、この戦略を採用している。 DCは、フローサイトメトリーにより監視することができます肺樹状細胞による迅速な取り込みにFITC-デキストラン結果の貪食、鼻腔内送達されているためです。例では、肺形質DCのモニタリングが望まれる場合、CFSEはemploなければなりません形質DCは他の肺のDCサブセット¹⁰として効率的に摂取FITC-デキストランないので、YED。

それは気道炎症の過程で肺のDCの成熟/移行の定量分析を提供していますのために完全に記載の戦略は、他の従来のアプローチに比べて利点を提供しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience