Summary
אנו מתארים אסטרטגיה לפקח התבגרות והגירה של תאים דנדריטים ריאה בתגובה ovalbumin בסביבה של דלקת דרכי הנשימה הנגרמת ovalbumin אלרגית. אסטרטגיה זו ניתן לשנות על מנת להעריך ההגירה של תאים דנדריטים ריאתי ההגדרות של זיהום.
Abstract
תאים דנדריטים (DCS) הם השחקנים המרכזיים המעורבים בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית ידי הפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. DCS נמצאים ברקמות הפריפריה במצב יציב, אולם בעקבות גירוי אנטיגן, DCS לקחת את האנטיגן במהירות נודדים אל קשרי הלימפה שם הם מרוקנים ליזום בתגובה תא T נגד 1,2 אנטיגן. בנוסף, DCS גם לשחק תפקיד מרכזי בייזום תגובה חיסונית אוטואימונית, כמו גם אלרגי 3.
DCS לשחק תפקיד חיוני הן ייזום של התגובה החיסונית אינדוקציה של סובלנות על רקע הסביבה ריאות 4. סביבה בריאה היא tolerogenic במידה רבה, בשל החשיפה מגוון רחב של אנטיגנים סביבתיים 5. עם זאת, אצל אנשים מסוימים יש הפסקה סובלנות, אשר מוביל אינדוקציה של אלרגיה ואסטמה. במחקר זה, אנו מתארים אסטרטגיה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על דרכי הנשימה התבגרות הבירה מיגהמנה בתגובה לאנטיגן המשמש רגישות. מדידה של התבגרות DC דרכי הנשימה והגירה מאפשר הערכה של קינטיקה של התגובה החיסונית בזמן דלקת דרכי הנשימה אלרגית וגם מסייע בהבנת סדר הגודל של התגובה החיסונית לאחר מכן יחד עם המנגנונים.
האסטרטגיה שלנו מבוססת על שימוש ovalbumin כסוכן רגישות. Ovalbumin-Induced אסתמה אלרגית היא מודל בשימוש נרחב להתרבות eosinophilia דרכי הנשימה, דלקת ריאות ו-IgE רמות שנמצאו במהלך אסטמה 6,7. לאחר רגישות, עכברים מאותגרים על ידי משלוח של אפי ovalbumin FITC שכותרתו, אשר מאפשר תיוג ספציפית של דרכי הנשימה אשר DCS ovalbumin ספיגת. לאחר מכן, באמצעות מספר סמנים הבירה מסוימים, אנחנו יכולים להעריך את ההבשלה של DCS אלה ניתן גם להעריך את הנדידה אל קשרי הלימפה וניקוז על ידי העסקת cytometry הזרימה.
Protocol
1. רגישות של עכברים עם Ovalbumin
- הכן פתרון של OVA (V בכיתה; Sigma, MO) ב סטרילית PBS בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל (הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C).
- על מנת להכין OVA-אלום התערובת, קח אלום בצינור ולהוסיף פתרון OVA באופן dropwise תוך vortexing צינור ביחס של 1:1. מערבבים את התערובת במשך 30 דקות ולהשתמש מיד לאחר ערבוב.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל, להזריק 0.2 מ"ל של התערובת לתוך חלל הצפק העכבר ולחזור על הזריקה שוב לאחר 2 שבועות.
2. האתגר של אפי עכברים עם Ovalbumin תווית FITC
- 7 ימים לאחר ההזרקה השנייה של אלום-OVA, עכברים מוכנים לערער intranasally עם OVA-FITC.
- הכן פתרון של OVA-FITC (Sigma) באמצעות PBS סטרילית בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ו חנות aliquots ב -80 ° C.
- מניחים גזה סטרילית בחלק התחתון של 50 מ"ל בז צינור וב h כימיOOD, מוסיפים 5 מ"ל של Aerrane על גזה. על מנת להרדים עכברים, לכוון את בעל החיים לתוך הצינור של כ 5-10 שניות.
- להחזיק את בעל החיים מורדם בתנוחה זקופה ושימוש טיפים פיפטה סטרילית, μl 100 פיפטה של פתרון OVA-FITC על גבי nares של עכברים בצורה טיפה חכם.
- חזור על האתגר אפי עם OVA-FITC ביומיים הקרובים.
3. הכנת תרחיף תא יחיד מן הריאות ואת בלוטות הלימפה וניקוז
- להקריב את העכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal של Euthanyl.
- על מנת להקטין את זיהום מקרופאג, מה שעלול לסבך את ניתוח DC, שטיפה ריאה מתבצע. כדי שטיפה של הריאות, וקנה הנשימה עכבר נחשפים לרגע cannulated עם קטטר ו מזרק, באמצעות קר כקרח PBS עם 5 mM EDTA, מערכת הנשימה התחתונה לשטוף 3 פעמים כדי להסיר את התאים מן החללים מכתשיים.
- Perfuse הריאות עם 10 מ"ל של PBS המכיל 10 U / ml heparבכל דרך החדר הימני של הלב, כדי להסיר כדוריות דם בכלי הדם של הריאות. בצע את perfusions עד הריאות להפוך לבן, מעיד על הסרת ביותר של כדוריות הדם. זה חשוב במיוחד להסרת תאים מזהמים מן הדם ההיקפי.
- לנתח את הריאות החוצה להסיר בלוטות הלימפה mediastinal (mln) ולמקם את בלוטות הלימפה צלחת נפרדת. (נסו לצמצם את החשיפה של רקמות להדליק למנוע מרווה FITC של הקרינה.)
- מניחים את הריאות על צלחת פטרי ו לרכך באמצעות מספריים. הבא לעכל את הריאות במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות 250 U / ml collagenase ד '(רוש) ולהוסיף EDTA (10 mM הריכוז הסופי) במשך 5 הדקות הבאות להפסיק פעילות collagenase.
- לעבור את שברי הריאות מתעכל דרך מסננת 100 מיקרומטר התא ולבצע תמוגה hypotonic להסיר אריתרוציטים. ההשעיה תא בודד הוא מוכן לניתוח נוסף של DCS.
- על מנת להכין את ההשעיה תא בודד מתוך mln, לאלהקל על mln באמצעות מחטים דקות ולעכל עם collagenase כמתואר לעיל ולאחריה מאמץ דרך מסננת התא.
4. מכתים עבור DC סמנים להעריך מטורציה / הגירה
- על מנת לזהות DCS בריאות, מכתים מבוצע CD11c ו CD11b. יתר על כן להעריך על התבגרות, מכתים מבוצע CD86 ו CD80, אשר שהוגברו כמו DCS עוברים התבגרות. CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln מזוהים DCS ריאתי נודדות מהריאות mln בתגובה לאתגר דרכי הנשימה OVA.
- להשעות תאים בריכוז של 10 x 10 6 תאים למ"ל ב FACS חיץ (PBS עם 1% FBS ו 1 מ"מ EDTA) ו 150 aliquot μl ההשעיה תא / צינור עבור מכתים FACS. זיהוי של DCS ריאה, כתמים הבאים נדרשים: שליטה בלא כתם (לתאי ריאה מעכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC שליטה, בקרה CD11c אחד, CD11b בקרה אחד, CD11b+ + CD11c בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + שליטה כפולה, CD11c + OVA-FITC + כפול שליטה, MHC II בקרה אחד, שליטה יחיד CD86, CD80 שליטה יחיד דגימות מוכתם עבור OVA-FITC + + CD11c CD11b + + MHCII , OVA-FITC + + CD11c CD11b + CD86 + ו-OVA FITC + + CD11c CD11b + CD80 +.
- כדי להעריך את ההגירה DC, לבצע ספירת תאים מוחלטים של השעיה תא בודד מתוך mln ולאחר מכן להכין את הצינורות הבאים: שליטה בלא כתם (תאים mln של עכברים שלא נחשפו OVA-FITC), OVA-FITC בקרה, CD11c + שליטה יחיד, CD11b + בקרה כפולה, CD11b + OVA-FITC + כפול שליטה, CD11c + OVA-FITC + כפול מלאה CD11c + CD11b + OVA-FITC דגימות +.
5. נציג תוצאות
את נקודות הזמן הנדרש רגישות intraperitoneal לגרום לדלקת דרכי הנשימה אלרגית חשוב וצריך להתבצע כפי מתואר באיור 1. בעקבות רגישות intraperitoneal ו OVA אתגר דרכי הנשימה, כדי לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית, עכברים כמה אפשר להקריב וניתוח היסטולוגית יכול להתבצע על החלקים ריאה כפי שמוצג באיור 2. הנוכחות של תאים דלקתיים שניתן לאשר על ידי Hematoxylin & Eosin הכתם (איור 2 א) ונוכחות של ייצור ליחה ניתן להעריך על ידי תקופתיים, חומצה שיף הכתם (איור 2 ב). בסך הכל זה יהיה לאשר גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית בעקבות האתגר של OVA OVA רגיש עכברים 8. לעומת זאת, חלקים מן ריאות בעכברים שטופלו מלוחים צפויים להיות ללא כל דלקת, יחד עם העדר כל ייצור ריר. יתר על כן, האתגר OVA הבאה, ריאות DCS unde RGO התבגרות והגירה לאחר ניקוז בלוטות הלימפה. ניתוח CD11c + תאים בקשרי הלימפה mediastinal (mln) מעכברים רגישים ו תיגר עם OVA צפויה להראות שיעור גבוה יותר של תאים CD11c + לעומת מלוחים שטופלו עכברים (איור 3 א). יתר על כן, ניתוח של ספירת תאים המוחלט של CD11c + CD11b + OVA-FITC + תאים mln של עכברים OVA רגיש וקרא תיגר, צפוי להראות באופן משמעותי גבוה יותר (כלומר פי כמה וכמה יותר) מספר כי עמיתיהם מן העכברים שטופלו מלוחים ( איור 3 ב).
באיור 1. פרוטוקול ניסיוני לזירוז של ovalbumin (OVA) דלקת דרכי הנשימה הנגרמת על אלרגיות אצל עכברים יחד עם האתגר דרכי הנשימה עם FITC ovalbumin שכותרתו (OVA-FITC).
fig2.jpg "/>
איור 2. רגישות OVA ואחריו אתגר דרכי הנשימה OVA מובילה גיוס של דלקת דרכי הנשימה אלרגית כמו מזוהה על ידי צביעה Hematoxylin & Eosin סעיפים ריאה המוצגים () וגם מוביל ייצור ליחה בדרכי הנשימה מזוהה על ידי צביעה שיף תקופתיים חומצה הריאה חלקים, כפי שמוצג (ב ').
איור 3. OVA-FITC אתגר גורם ההגירה DC מהריאות אל קשרי הלימפה mediastinal (mln). (א) מגרשים cytometry זרימה המתאר את הפרופורציות של CD11c + תאים mln שליטה או OVA רגיש עכברים. (ב) מונה מוחלטים של CD11c + CD11b + OVA-FITC תאים + ב mln של עכברים מלוחים או OVA-רגיש. * P <0.05. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מציעה cytometry זרימת הגישה מבוססת על ניתוח DCS ריאתי, המבוססים על משלוח של OVA-FITC לאתגר דרכי הנשימה. זה מאפשר ניטור סלקטיבי של DCS ריאתי, אשר תופסים OVA-FITC ולכן האוכלוסיות DC, אשר נמצאות תחת פיקוח הם למעשה אלה המשתתפים בתגובה החיסונית דרכי הנשימה במהלך OVA דלקת דרכי הנשימה הנגרמת אלרגית. בעכברים שליטה, בהעדר דלקת דרכי הנשימה אלרגית, מספר DCS נודדות (OVA-FITC + DCS) שזוהו mln מעידים על שיעורי הבסיס של DC הגירה, המאיצה בתגובה לדלקת דרכי הנשימה אלרגית והתוצאה היא עלייה משמעותית מספר המוחלט של OVA-FITC + DCS ב mln. האסטרטגיה המתוארת, מציע יתרון על פני immunohistochemical / immunostaining הגישות המסורתיות המבוססות על ניתוח כי יכול להתבצע בפרק זמן קצר יותר, ואת יעילות / רגישות גבוהה הרבה יותר. לכן החשוב qually על מנת להבטיח כי הפקדים המתאימים כמתואר השיטות מועסקים במהלך ניתוח cytometry הזרימה. פרמטר נוסף שיכול להשפיע על התוצאות היא הכנת תרחיף תאים אחת מן הריאות. לפיכך יש להקפיד, כדי למנוע חשיפה משמעותית של רקמת להדליק בשביל זה עשוי להשפיע על הקרינה של OVA-FITC וטיפול חייב גם לקחת במהלך העיכול האנזימטית של הריאה לעיכול מעל עלול להוביל המחשוף של סמנים פני השטח על תאים, אשר ישפיע על ניתוח במורד הזרם. מקרופאגים מכתשיים ו DCS לשתף סטים דומים של סמנים פני השטח, אשר עוד יותר מסבך את ניתוח ריאתי אוכלוסיות 9-DC. לכן זה הכרחי כדי שטיפה הריאות להסיר מקרופאגים מכתשיים אשר יכול להפריע ניתוח DC.
בנוסף לניתוח ההגירה DC ריאתי בזמן דלקת דרכי הנשימה אלרגית, המתודולוגיה המתוארת ניתן לשנות באופן פוטנציאלי להעריך תגובה חיסונית אחרתtigens, לפיה אנטיגנים מסוימים יכול להיות מתויג עם פלורסנט לצבוע ונמסרו intranasally. ניתוחים דומים בהמשך כפי שתוארו לעיל ניתן לבצע על מנת להעריך ריאתי בתגובה DC. במקרים בהם אנטיגן לא יכול להיות מתויג, שעות ספורות לפני המסירה אנטיגן, FITC-dextran או CFSE ניתן יהיה להעביר את העכברים. לאחר מכן, לאחר הלידה אנטיגן, ניתוח יכול להתבצע לפקח ההגירה של FITC-dextran או CFSE שכותרתו DCS כדי mln, אשר יציין את הקינטיקה של הגירה DC ריאתי לאחר חיסון עם האנטיגן הספציפי 10,11. בעבודה הקודמת שלנו, השתמשנו באסטרטגיה זו כדי להעריך את בשלות / הגירה של DCS ריאה בתגובה מסירת adenoviral טיפול וקטורים גנים 10. מאז הם DCS משלוח phagocytic, אפי של FITC-dextran גורמת ספיגת מהירה על ידי DCS ריאתי, אז מה שיכול להיות במעקב על ידי cytometry הזרימה. במקרים, בהם פיקוח על ריאתי plasmacytoid DCS הוא הרצוי, CFSE צריכים להיות מועסקיםyed מאז DCS plasmacytoid לא ספיגת FITC-dextran בצורה יעילה ככל אחרות תת הבירה ריאתי 10.
בסך הכל, האסטרטגיה המתוארת מציע יתרונות על פני הגישות המסורתיות אחרות הוא מציע ניתוח כמותי של התבגרות הבירה הגירה ריאתי / במהלך דלקת דרכי הנשימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענקים CIHR ו CF קנדה ד"ר ג'ים הו על ידי studentship PhD הוענק רהול Kushwah ידי CF קנדה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Alum | Thermo Scientific | 77161 | |
| OVA-FITC | Sigma-Aldrich | A9771 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Antibodies | e-Bioscience |
References
- Kushwah, R., Hu, J. Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells. Cell Biosci. 20, (2011).
- Kushwah, R., Hu, J. Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system. Immunology. 133, 409-419 (2011).
- Lambrecht, B. N., Hammad, H. Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma. Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma. Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).
- Lloyd, C. M., Murdoch, J. R.
- Herz, U. The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma. Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).
- Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses. Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).
- Nakae, S. TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).
- Guth, A. M. Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).
- Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery. J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).
- Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells. J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).
