Анализ легких созревание дендритных клеток и миграции в течение аллергического воспаления дыхательных путей

Summary

Мы описываем стратегии для контроля созревания и миграции легких дендритные клетки в ответ на овальбумина в условиях овальбумина индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей. Эта стратегия может быть изменена для оценки миграции легких дендритных клеток в условиях заражения.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются ключевыми игроками участвуют в инициации иммунного ответа, активируя антиген-специфических Т-клеток. ДК присутствуют в периферических тканях, в установившемся режиме, однако в связи с антигенной стимуляции, ДК занимает антиген и быстро перейти на дренаж лимфатических узлов, где они инициируют Т-клеточного ответа против антигенов ^1,2. Кроме того, контроллеры домена также играют ключевую роль в инициации аутоиммунных и аллергических иммунных реакций ^3.

ДК играет важную роль как в начале иммунного ответа и индукции толерантности в условиях легкого среды ^4. Легкие среды в значительной степени вызывающий иммунологическую толерантность, в связи с воздействием широкого спектра экологических антигенов ^5. Тем не менее, у некоторых людей есть перерыв в терпимости, что приводит к индукции аллергии и астмы. В этом исследовании мы опишем стратегию, которая может быть использована для контроля дыхательных путей постоянного созревания и миграцион в ответ на антиген для сенсибилизации. Измерение постоянного тока дыхательных путей созревания и миграции позволяет для оценки кинетики иммунного ответа в течение аллергического воспаления дыхательных путей, а также помогает в понимании масштабов последующего иммунного ответа, а также основные механизмы.

Наша стратегия основана на использовании в качестве овальбумина сенсибилизирующего агента. Ovalbumin вызванного аллергической астмы является широко используемой модели, чтобы воспроизвести дыхательных путях эозинофилов, воспаления легких и повышенный уровень IgE, найденные во время астмы ^6,7. После сенсибилизации мышей оспорено интраназального доставки FITC помечены овальбумина, который позволяет для конкретных маркировки дыхательных путей домена который поглощение овальбумина. Далее, используя несколько DC специфических маркеров, мы можем оценить созревания этих контроллеров домена, а также может оценить их миграции в дренаж лимфатических узлов, используя проточной цитометрии.

Protocol

1. Сенсибилизация мышей с Ovalbumin

1. Приготовьте раствор OVA (класс В; Sigma, MO) в стерильном PBS в концентрации 1 мг / мл (раствор можно хранить при температуре -80 ° С).
2. Для того чтобы подготовить OVA-алюм смесь, возьмите Квасцы в трубку и добавить OVA решение в моде в то время как по каплям встряхивая трубу в соотношении 1:1. Размешайте смесь в течение 30 минут и использовать сразу после смешивания.
3. С помощью 1 мл шприц, вводят 0,2 мл смеси в брюшную полость мышей и повторить инъекцию через 2 недели.

2. Интраназально Проблема Мыши с FITC Маркированный Ovalbumin

1. 7 дней после второй инъекции OVA-алюм, мышей готовы быть оспорены интраназально ОВА-FITC.
2. Приготовьте раствор ОВА-FITC (Sigma) с помощью стерильной PBS в концентрации 1 мг / мл и хранят в аликвоты при -80 ° C.
3. Положите стерильную марлю в нижней части 50 мл сокол трубку и в химической чдревесины, добавляют 5 мл Aerrane на марлю. Для того, чтобы обезболить мышей, направить животное в трубу примерно на 5-10 секунд.
4. Держите под наркозом животным в вертикальном положении и стерильные наконечники, пипетки 100 мкл FITC ОВА-решение на ноздри мышей в каплям моды.
5. Повторите интраназального проблемы с ОВА-FITC в течение ближайших двух дней.

3. Подготовка Single-клеточной суспензии из легких и лимфатических узлов слива

1. Жертвоприношение мышах внутрибрюшинного введения Euthanyl.
2. В целях снижения загрязнения макрофагов, которые могут осложнить постоянного анализа, легких осуществляется промывание. Для промывания легких, трахеи мыши кратко разоблачены и канюлю с катетер и шприц, использование ледяной PBS с 5 мМ ЭДТА, нижних дыхательных путей, промывают 3 раза для удаления клеток из альвеолярного пространства.
3. Заливать легкие с 10 мл PBS, содержащего 10 ЕД / мл печенив через правый желудочек сердца, для удаления клеток крови из легких сосудов. Выполните перфузии до легких становятся белыми, что свидетельствует о удалении большинства клеток крови. Это особенно важно, чтобы удалить загрязнения клеток из периферической крови.
4. Проанализируйте легкие и удалить лимфатические узлы средостения (МЛН) и поместить в лимфатические узлы в отдельном блюде. (Постарайтесь свести к минимуму воздействие на ткани, на свет, чтобы предотвратить тушение флуоресценции FITC).
5. Поместите легких на чашку Петри и пропустить через мясорубку с помощью ножниц. Следующая переварить легких в течение 25 минут при температуре 37 ° C помощью 250 ед / мл коллагеназы D (Roche) и добавить ЭДТА (10 мМ конечной концентрации) в течение следующих 5 минут, чтобы остановить активность коллагеназы.
6. Передача фрагментов переваривается легкие через сито 100 мкм и клетки выполняют гипотонический лизис для удаления эритроцитов. Суспензии отдельных клеток, готова к дальнейшему анализу DC.
7. В целях подготовки суспензии отдельных клеток от млн тоблегчить МЛН с использованием тонких игл и дайджест коллагеназы, как описано выше следует напряжения через ячейки фильтра.

4. Окрашивание для постоянного маркеров для оценки созревания / миграция

1. Для того чтобы определить домена в легких, окрашивание выполняется для CD11c и CD11b. Кроме того, чтобы оценить для созревания, окрашивание выполняется для CD86 и CD80, которые upregulated как контроллеры домена пройти созревания. CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ клеток в МЛН определены как легочный домена переходе от легких к МЛН в ответ на проблемы дыхательных путей OVA.
2. Приостановить клеток в концентрации 10 х 10 ⁶ клеток / мл в FACS буфером (PBS с 1% FBS и 1 мМ ЭДТА) и аликвоты 150 мкл суспензии клеток / трубка для окрашивания FACS. Для идентификации легких домена, после окраски необходимо: Неокрашенные управления (клетки легких от мышей не подвергается OVA-FITC), ОВА-FITC контроля, CD11c один элемент управления, CD11b один элемент управления, CD11b^{+ +} CD11c двойной контроль, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ двойной контроль, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ двойной контроль, MHC II единый орган управления, CD86 один элемент управления, CD80 единого управления и образцы окрашивали OVA-FITC ^{+ +} CD11c CD11b ^{+ +} MHCII , ОВА-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD86 ⁺ CD11b ⁺ и OVA-FITC ⁺ CD11c ⁺ CD80 ⁺ CD11b ^+.
3. Для оценки DC миграции, выполняет абсолютное количество клеток в суспензии отдельных клеток от МЛН, а затем подготовить следующие трубы: Неокрашенные управления (МЛН клеток мышей не подвергается OVA-FITC), ОВА-FITC контроля, CD11c ⁺ один элемент управления, CD11b ⁺ двойной контроль, CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ двойной контроль, CD11c ⁺ OVA-FITC ⁺ двойной контроль и CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ образцы.

5. Представитель Результаты

Моменты времени, необходимое для внутрибрюшинного сенсибилизации, чтобы вызвать аллергическое воспаление дыхательных путей является важным и должно осуществляться, как показано на рисунке 1. После внутрибрюшинного сенсибилизации и проблемы дыхательных путей OVA, чтобы подтвердить индукции аллергического воспаления дыхательных путей, некоторых мышей можно пожертвовать и гистологические исследования могут быть проведены на легких разделов, как показано на рисунке 2. Наличие воспалительных клеток может быть подтверждено гематоксилин-эозином (рис. 2A) и наличии слизи может быть оценен по Периодической-кислотно-Шифф пятно (рис. 2В). Всего это подтвердит индукции аллергического воспаления дыхательных путей после ОВА задача ОВА-сенсибилизированных мышей ^8. В отличие от легких профилей из соленой мышей, как ожидается, быть свободным от любых воспалений, а также отсутствие слизи. Кроме того, следующие задачи OVA, легочная домена недеформированной РГО созревания и последующего перехода на дренаж лимфатических узлов. Анализ CD11c ⁺ клеток в лимфатические узлы средостения (МЛН) у мышей чувствительных и сталкиваются с проблемой OVA, как ожидается, показывают более высокую долю CD11c ⁺ клеток по сравнению с физиологическим раствором мышей, получавших (рис. 3А). Кроме того, анализ абсолютного количества клеток в CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ клеток в млн. OVA-чувствительных и призвал мышей, как ожидают, покажет значительно выше (то есть в несколько раз выше) количество, что коллеги из солевых мышей ( Рисунок 3B).

Рисунок 1. Экспериментальный протокол для индукции овальбумина (OVA), индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей у мышей, а также дыхательных путей, проблемы с FITC помечены овальбумина (OVA-FITC).

fig2.jpg "/>
Рисунок 2. OVA сенсибилизации следует OVA проблемы дыхательных путей приводит к индукции аллергического воспаления дыхательных путей, как это определено гематоксилин-эозином легких разделах показано в (A), а также приводит к слизи в дыхательных путях, определенных периодического окрашивания Шифф кислота легких разделов, как показано на (B).

Рисунок 3. ОВА-FITC проблема вызывает DC миграции из легких в лимфатические узлы средостения (МЛН). (A) участки проточной цитометрии изображающие пропорции CD11c ⁺ клеток в МЛН контроля или OVA-чувствительных мышей. (Б) Абсолютная пунктам CD11c ⁺ CD11b ⁺ OVA-FITC ⁺ клеток в МЛН физиологического раствора или OVA-чувствительных мышей. * Р <0,05. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Метод, представленные здесь предлагается проточной цитометрии подход, основанный на анализе легочной РС, основанные на поставку OVA-FITC для отвода дыхательных путей. Это позволяет выборочный мониторинг легких домена, которые занимают OVA-FITC и, следовательно, постоянного населения, которые контролируются эффективно те, которые принимают участие в дыхательные пути иммунного ответа в течение ОВА-индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей. В контрольных мышей, в отсутствие аллергического воспаления дыхательных путей, число мигрирующих РС (OVA-FITC + DC), определенных в МЛН свидетельствуют о базальной скорости DC миграции, которая ускоряется в ответ на аллергическое воспаление дыхательных путей приводит к значительному увеличению абсолютное количество OVA-FITC + домена в МЛН. Описанная стратегия предлагает преимущества по сравнению с традиционными иммуногистохимического / иммунной подходы, потому что анализ может быть осуществлен в более короткие, промежуток времени, а также эффективность / чувствительность намного выше. Поэтому электроннаяqually важным для обеспечения надлежащего управления, как описано в методы применяются при анализе потока цитометрии. Другой параметр, который может повлиять на результаты, является подготовка суспензии отдельных клеток из легких. Поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить значительное воздействие на ткани на свету оно может повлиять на флуоресценцию OVA-FITC и уход должны быть приняты во время ферментативного переваривания более легкого пищеварения может привести к расщеплению поверхностных маркеров на клетках, которые повлияет ниже анализа. Альвеолярных макрофагов и ДК сходные наборы поверхностных маркеров, что еще больше усложняет анализ легочной населения DC ^9. Поэтому очень важно промывание легких удалить альвеолярные макрофаги, которые могут помешать анализу DC.

В дополнение к анализу легочной миграции постоянного тока в течение аллергического воспаления дыхательных путей, описанные методологии потенциально может быть изменен, чтобы оценить иммунный ответ на другиеtigens, в которой специфические антигены могут быть помечены флуоресцентным красителем и доставлены интраназально. Впоследствии аналогичный анализ, как описано выше, может быть проведено для оценки легочной ответ DC. В случаях, когда антигены не могут быть помечены, за несколько часов до доставки антигена, FITC-декстран или CFSE могут быть доставлены в мышей. Затем, после доставки антигена, анализ может быть осуществлен для мониторинга миграции FITC-декстран или CFSE помечены РС млн, что будет указывать на кинетику легочной миграции DC после прививки специфический антиген ^10,11. В нашей предыдущей работе мы использовали эту стратегию для оценки созревания / миграции легких домена в ответ на поставки аденовирусной генной терапии векторы ^10. Поскольку контроллеры домена являются фагоцитарной, интраназально доставки FITC-декстран приводит к быстрому поглощению легочную контроллеры домена, которые затем могут быть проверены с помощью проточной цитометрии. В случаях, когда мониторинг легочной plasmacytoid домена желательно, должно быть CFSE employed с plasmacytoid домена не поглощение FITC-декстран так же эффективно, как и другие легочные подмножества DC ^10.

В целом, описанные стратегия дает преимущества по сравнению с другими традиционными подходами к нему предлагает количественный анализ легких созревания DC / миграции в ходе воспаления дыхательных путей.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Alum	Thermo Scientific	77161
OVA-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Collagenase D	Roche	11088858001
Antibodies	e-Bioscience