Descrevemos a preparação de fator de crescimento de células T utilizado para a expansão in vitro de antígeno-específica de linfócitos T linhas rato.
Abstract
Manutenção de antígeno-específicas linhas de células T ou clones na cultura exige rodadas de antígeno-induzida ativação separados por fases de 1,2 expansão celular. Adição de interleucina 2 para o meio de cultura durante a fase de expansão é necessária para evitar a morte celular e suficiente para manter a curto prazo linhas de células T, mas foi mostrado para aumentar a polarização Th1 3. Substituição de interleucina 2 pelo fator de crescimento de células T (TCGF), que contém uma mistura de citocinas é mais eficaz do que a interleucina 2 na manutenção a longo prazo linhas de células T in vitro 3. Além disso, TCGF pode ser facilmente preparado em grandes quantidades no laboratório e é muito mais barato do que a interleucina 2 recombinante.
Aqui, vamos mostrar como preparar TCGF sobrenadantes de esplenócitos de ratos cultura. Para este procedimento, colhemos baços de ratos Lewis ingênuo sacrificados para timo e coleta de sangue. Nós preparamos uma única célula suspensões de baço, Lyze as células vermelhas do sangue por choque osmótico, ea semente da esplenócitos em meio de cultura. As células são estimuladas com concanavalina A, um mitógeno que os não-seletivamente ativa todos os linfócitos T de ratos, induzindo a produção de citocinas. A cultura é supernantant coletadas 48 horas depois concanavalina A andexcess é obrigado a alfa metil mannoside para impedi-lo de ativar linhas de células T para que TCGF será adicionado. O TCGF é então filtrado estéril, aliquotado e armazenado a -20 ° C.
Protocol
Tome baços de ratos Lewis (ratos entre 160-200g são os melhores). Dilacerar no gelo numa placa de Petri contendo PBS + antibióticos (PBS-PS) usando um filtro de células. Coloque em um tubo de 50 ml. Preencher com PBS-PS. Giro por 10 min a 4 ° C para agregar as células. Lave as células duas vezes. Ressuspender o sedimento em NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por baço). Misture delicadamente e de forma contínua com uma pipeta de 3 min no gelo para lisar as hemácias. Encha o tubo com …
Discussion
Nós preparamos TCGF de esplenócitos de ratos Lewis, uma vez que regularmente euthanize ratos ingênuos a partir desta cepa para a colheita de soro e thymi para estimular ratos Lewis linhas de células T in vitro. Este TCGF pode ser usado para promover o crescimento ea sobrevivência de linhagens de células T das estirpes outro rato. TCGF também podem ser preparados a partir de outras linhagens de ratos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.