وصفنا إعداد الخلايا التائية عامل النمو المستخدمة في المختبر في التوسع من الفئران محددة مستضد خطوط تي اللمفاوية.
Abstract
صيانة خطوط محددة مستضد الخلايا التائية أو استنساخ في الثقافة يتطلب جولات من مستضد التي يسببها تفعيل مفصولة مراحل التوسع 1،2 الخلية. إضافة انترلوكين 2 إلى وسائل الإعلام الثقافة خلال مرحلة التوسع ضروري لمنع موت الخلايا وكافية للحفاظ على المدى القصير خطوط الخلايا T ولكن ثبت لزيادة الاستقطاب TH1 3. استبدال انترلوكين 2 بواسطة الخلايا التائية عامل النمو (TCGF) الذي يحتوي على مزيج من السيتوكينات هو أكثر فعالية من انترلوكين 2 في الحفاظ على المدى الطويل خطوط الخلايا التائية في المختبر 3. وعلاوة على ذلك ، يمكن بسهولة TCGF تكون مستعدة بكميات كبيرة في المختبر ، وأرخص بكثير من المؤتلف انترلوكين 2.
هنا ، وتبين لنا كيفية تحضير TCGF من الفئران supernatants ثقافة خلية طحالية. لهذا الإجراء ، ونحن الحصاد الطحال من الفئران لويس السذاجة الموت الرحيم لجمع الدم والغدة الصعترية. نحن نستعد وحيدة الخلية الحذف من الطحال ، lyze خلايا الدم الحمراء من صدمة ناضح ، والبذور splenocytes في المتوسط الثقافة. يتم تحفيز الخلايا مع كونكانافالين A ، وهو أن mitogen غير انتقائي تنشيط الخلايا اللمفية تي جميع الفئران ، الأمر الذي أدى إلى إنتاج السيتوكينات. يتم جمع supernantant الثقافة بعد 48 ساعة كونكانافالين andexcess منضما إلى mannoside الميثيل ألفا لمنعها من تفعيل خطوط الخلايا التائية التي ستضاف TCGF. وTCGF غير معقمة ، ثم تمت تصفيتها ، aliquoted ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
Protocol
تأخذ الطحال الفئران لويس (الجرذان بين 200G – 160 هي الأفضل). Dilacerate على الجليد في طبق بتري تحتوي على المضادات الحيوية PBS + (PBS – PS) باستخدام مصفاة الخلية. وضعت في أنبوب 50 مل. تمتلئ PBS – PS. تدور لمدة 10 دقيقة على 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية. </li…
Discussion
نحن نستعد TCGF من splenocytes الفئران لويس لأننا الموت ببطء بانتظام الفئران ساذج من هذه السلالة لحصاد المصل والتوتة لتحفيز خلايا الفئران خطوط لويس تي في المختبر. ويمكن استخدام هذا TCGF لتعزيز النمو والبقاء على قيد الحياة من خطوط الخلايا التائية من سلالات الفئران الأخرى. ويمكن أيضا أن تك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.