Wir beschreiben die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor für die in vitro Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Ratte-Linien verwendet.
Abstract
Wartung von Antigen-spezifischen T-Zell-Linien oder Klone in Kultur erfordert Runden von Antigen-induzierte Aktivierung von Phasen der Zellexpansion 1,2 getrennt. Die Zugabe von Interleukin-2 zum Kulturmedium während der Expansionsphase ist notwendig, um den Zelltod zu verhindern und ausreichend, um kurzfristige T-Zell-Linien zu erhalten, hat aber gezeigt, dass Th1 Polarisierung 3 zu erhöhen. Ersatz von Interleukin-2 durch T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF), die eine Mischung von Zytokinen enthält, ist effektiver als Interleukin-2 in die Pflege langfristiger T-Zelllinien in vitro 3. Darüber hinaus können TCGF leicht in großen Mengen im Labor hergestellt werden und ist viel billiger als rekombinante Interleukin-2.
Hier zeigen wir, wie man TCGF aus Ratten-Splenozyten Kulturüberständen vorzubereiten. Für dieses Verfahren, ernten wir Milzen von naiven Lewis Ratten Thymus und Blutentnahme getötet. Wir bereiten Einzel-Zellsuspensionen aus der Milz, lysieren die Erythrozyten durch osmotischen Schock und Saatgut die Splenozyten in Kulturmedium. Die Zellen werden mit Concanavalin A, ein Mitogen, dass nicht-selektiv aktiviert alle Ratten T-Lymphozyten, induziert die Produktion von Zytokinen stimuliert. Die Kultur supernantant 48 Stunden später ist andexcess Concanavalin gesammelt A ist alpha Methylmannosid gebunden, um es von der Aktivierung T-Zell-Linien, auf die TCGF hinzugefügt werden verhindern. Die TCGF wird dann sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C.
Protocol
Nehmen Sie Lewis Ratte Milz (Ratten zwischen 160-200g sind am besten). Dilacerate auf Eis in einer Petrischale mit PBS + Antibiotika (PBS-PS) unter Verwendung einer Zelle Sieb. Setzen Sie in einer 50 ml Tube. Füllen mit PBS-PS. Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen zweimal. Das Pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml pro Milz). Vorsichtig mischen und kontinuierlich mit einer Pipette für 3 min auf Eis, um die Erythrozyten zu lysieren. Füllen Sie …
Discussion
Wir bereiten TCGF von Lewis Ratte Splenozyten da wir einschläfern regelmäßig naive Ratten von dieser Sorte zu ernten Serum und Thymi zu Lewis Ratten T-Zelllinien in vitro zu stimulieren. Diese TCGF kann verwendet werden, um das Wachstum und Überleben von T-Zell-Linien aus anderen Zuchtlinien gefördert werden. TCGF können auch von anderen Stämmen von Ratten vorbereitet werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.