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Biology

Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat

doi: 10.3791/402 Published: October 31, 2007

Summary

Abbiamo descritto la preparazione del fattore di crescita delle cellule T utilizzato per la espansione in vitro di linee di ratto antigene-specifica dei linfociti T.

Abstract

Manutenzione di linee T antigene-specifiche cellule o cloni in cultura richiede round di antigene-indotta attivazione separate da fasi di espansione delle cellule 1,2. L'aggiunta di interleuchina 2 al mezzo di coltura durante la fase di espansione è necessario per evitare la morte cellulare e sufficienti per mantenere a breve termine le linee di cellule T, ma ha dimostrato di aumentare la polarizzazione Th1 3. Sostituzione di interleuchina 2 da parte del fattore di crescita delle cellule T (TCGF), che contiene un mix di citochine è più efficace di interleuchina 2 nel mantenimento a lungo termine le linee di cellule T in vitro 3. Inoltre, TCGF può essere facilmente preparato in grandi quantità in laboratorio ed è molto più conveniente rispetto ricombinante interleuchina 2.

Qui mostriamo come preparare TCGF da sovranatanti ratto splenocyte. Per questa procedura, abbiamo raccolto milza di topi Lewis ingenuo eutanasia per timo e la raccolta del sangue. Ci prepariamo a cella singola sospensioni dalla milza, Lyze i globuli rossi da shock osmotico, e la stirpe della splenociti nel terreno di coltura. Le cellule sono stimolate con concanavalina A, un mitogeno che non si attiva selettivamente tutti i linfociti T di ratto, inducendo la produzione di citochine. La cultura è supernantant raccolte 48 ore più tardi andexcess concanavalina A è destinato a mannoside alfa metil per evitare che l'attivazione di linee di cellule T a cui TCGF saranno aggiunti. Il TCGF viene poi filtrata sterile, frazionare e conservati a -20 ° C.

Protocol

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  1. Prendere milza ratto Lewis (ratti tra 160-200g sono i migliori). Dilacerate sul ghiaccio in una capsula di Petri contenente PBS + antibiotici (PBS-PS) usando un colino cellulare. Mettere in una provetta da 50 ml. Riempire con PBS-PS.
  2. Spin per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule.
  3. Lavare le cellule due volte.
  4. Risospendere il pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml per milza). Mescolare delicatamente e continuamente con una pipetta per 3 minuti sul ghiaccio per la lisi degli eritrociti. Riempire il tubo con il mezzo.
  5. Spin per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule.
  6. Lavare le cellule due volte.
  7. Contare le cellule. Un ratto milza dà 200-250000000 cellule.
  8. Semi di cellule a 2 milioni per ml di terreno completo: 50 ml per 75 cm 2 pallone.
  9. Lasciate crescere per 48 ore in incubatrice.
  10. Spin 15 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
  11. Raccogliere il sopranatante; scartare le cellule.
  12. Aggiungere 15 mg / ml al mannoside metile il sopranatante. Mescolare accuratamente.
  13. Filtro (0,2 mm)
  14. Aliquota e conservare a -20 ° C. Può essere conservato a 4 ° C per 10 giorni se necessario.

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Discussion

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Prepariamo TCGF da splenociti di ratto Lewis da quando abbiamo regolarmente eutanasia ratti ingenuo da questo ceppo alla raccolta del siero e Thymi per stimolare Lewis ratto linee di cellule T in vitro. Questo TCGF può essere utilizzato per promuovere la crescita e la sopravvivenza di linee cellulari T da altri ceppi di topo. TCGF può anche essere preparata da altri ceppi di topi.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PBS, 1x, sterile Reagent GIBCO, by Life Technologies 14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x Reagent Sigma-Aldrich P0781 Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter Tool Fisher Scientific 08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl) Reagent Sigma-Aldrich A0171 Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640 Reagent GIBCO, by Life Technologies 21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) Reagent GIBCO, by Life Technologies 16140-071 Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine Reagent Cambrex/BioWhittaker 17-718R PSG
RPMI vitamins, 100x Reagent Sigma-Aldrich R7256
Sodium pyruvate, 100x Reagent Sigma-Aldrich S8636
Non-essential amino acids, 100x Reagent Sigma-Aldrich
Beta-mercapt–thanol Reagent Sigma-Aldrich M7522
alpha methyl mannoside Reagent Sigma-Aldrich M6882
Concanavalin A Reagent Sigma-Aldrich M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A.

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References

  1. Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
  2. Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
  3. Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Preparazione T fattore di crescita cellulare da splenociti Rat
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Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).More

Beeton, C., Chandy, K. G. Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes. J. Vis. Exp. (10), e402, doi:10.3791/402 (2007).

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