Biz, antijen-spesifik sıçan T lenfosit hatları in vitro genişlemesi için kullanılan T hücre büyüme faktörü hazırlık açıklar.
Abstract
Hücre genişleme 1,2 evreleri ayrılmış antijen-bağlı aktivasyon kültür antijen spesifik T hücre hatları veya klonlar Bakım mermi gerektirir. IL-2, genişleme aşamasında kültür ortamı eklenmesi hücre ölümü önlemek için gerekli ve kısa vadeli T hücre hatları korumak için yeterli ama Th1 kutuplaşma 3 artış görülmüştür . Sitokinlerin bir karışımını içeren T hücre büyüme faktörü (TCGF) IL-2 Yedek interlökin 2 3 in vitro uzun vadeli T hücre hatlarının korunmasında daha etkili. Ayrıca, laboratuvarda büyük miktarlarda TCGF kolayca hazırlanır ve rekombinant interlökin 2 çok daha ucuz olabilir.
Burada, sıçan splenocyte kültür süpernatantlar TCGF nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu işlem için, biz, timus ve kan toplama için ötenazi naif Lewis sıçan dalak hasat. Biz kültür ortamında dalak, dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak, kırmızı kan hücrelerinin ozmotik şok lyze ve tohum. Concanavalin A, non-selektif olarak sitokinlerin üretimini indükleyen, tüm sıçan T lenfositleri aktive olduğunu mitojenle hücreleri uyarılır. Kültür supernantant andexcess Concanavalin 48 saat sonra toplanan bir TCGF eklendi olacak T hücre hatları aktive önlemek için alfa metil mannoside bağlıdır. TCGF sonra, steril filtrelenmiş aliquoted ve -20 ° C'de saklanır.
Protocol
Lewis sıçan dalak (160-200g arasında fareler en iyi) ele alalım. Bir hücre süzgeç kullanarak PBS + antibiyotikler (PBS-PS) içeren bir petri buz Dilacerate. 50 ml'lik bir tüp içinde koyun. PBS-PS ile doldurun. 4 10 dakika Spin ° C pelet hücreleri. Hücreler iki kez yıkayın. Pelet NH 4 Cl 0.15 M (dalak başına 5 ml) tekrar Eritrositler lyse buz üzerinde 3 dakika süreyle bir pipetlemeyin yavaşça ve sürekli karıştırın. Orta tüp doldurun. 4 10 d…
Discussion
Düzenli olarak naif sıçanlarda serum ve thymi in vitro Lewis sıçan T hücre hatları teşvik etmek için hasat bu gerginlik euthanize beri Lewis sıçan splenositlerin TCGF hazırlar. Bu TCGF diğer sıçan suşları T hücre hatlarının büyüme ve hayatta kalma teşvik etmek için kullanılabilir. TCGF sıçan diğer suşları hazırlanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.