Summary
Wir beschreiben die Herstellung von T-Zell-Wachstumsfaktor für die in vitro Expansion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten-Ratte-Linien verwendet.
Abstract
Wartung von Antigen-spezifischen T-Zell-Linien oder Klone in Kultur erfordert Runden von Antigen-induzierte Aktivierung von Phasen der Zellexpansion 1,2 getrennt. Die Zugabe von Interleukin-2 zum Kulturmedium während der Expansionsphase ist notwendig, um den Zelltod zu verhindern und ausreichend, um kurzfristige T-Zell-Linien zu erhalten, hat aber gezeigt, dass Th1 Polarisierung 3 zu erhöhen. Ersatz von Interleukin-2 durch T-Zell-Wachstumsfaktor (TCGF), die eine Mischung von Zytokinen enthält, ist effektiver als Interleukin-2 in die Pflege langfristiger T-Zelllinien in vitro 3. Darüber hinaus können TCGF leicht in großen Mengen im Labor hergestellt werden und ist viel billiger als rekombinante Interleukin-2.
Hier zeigen wir, wie man TCGF aus Ratten-Splenozyten Kulturüberständen vorzubereiten. Für dieses Verfahren, ernten wir Milzen von naiven Lewis Ratten Thymus und Blutentnahme getötet. Wir bereiten Einzel-Zellsuspensionen aus der Milz, lysieren die Erythrozyten durch osmotischen Schock und Saatgut die Splenozyten in Kulturmedium. Die Zellen werden mit Concanavalin A, ein Mitogen, dass nicht-selektiv aktiviert alle Ratten T-Lymphozyten, induziert die Produktion von Zytokinen stimuliert. Die Kultur supernantant 48 Stunden später ist andexcess Concanavalin gesammelt A ist alpha Methylmannosid gebunden, um es von der Aktivierung T-Zell-Linien, auf die TCGF hinzugefügt werden verhindern. Die TCGF wird dann sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C.
Protocol
- Nehmen Sie Lewis Ratte Milz (Ratten zwischen 160-200g sind am besten). Dilacerate auf Eis in einer Petrischale mit PBS + Antibiotika (PBS-PS) unter Verwendung einer Zelle Sieb. Setzen Sie in einer 50 ml Tube. Füllen mit PBS-PS.
- Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal.
- Das Pellet in NH 4 Cl 0,15 M (5 ml pro Milz). Vorsichtig mischen und kontinuierlich mit einer Pipette für 3 min auf Eis, um die Erythrozyten zu lysieren. Füllen Sie das Röhrchen mit Medium.
- Spin für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal.
- Zählen Sie die Zellen. Eine Ratte Milz gibt 200 bis 250.000.000 Zellen.
- Seed die Zellen bei 2 Millionen pro ml in komplettem Medium: 50 ml pro 75 cm 2-Kolben.
- Lassen Sie wachsen für 48 Stunden in den Brutschrank.
- Spin 15 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren.
- Sammeln Sie die überstehende, entsorgen Sie die Zellen.
- Add 15 mg / ml eine Methylmannosid den Überstand. Gründlich mischen.
- Filter (0,2 mm)
- Aliquotieren und bei -20 ° C. Kann bei 4 ° C für 10 Tage, wenn nötig gehalten werden.
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Discussion
Wir bereiten TCGF von Lewis Ratte Splenozyten da wir einschläfern regelmäßig naive Ratten von dieser Sorte zu ernten Serum und Thymi zu Lewis Ratten T-Zelllinien in vitro zu stimulieren. Diese TCGF kann verwendet werden, um das Wachstum und Überleben von T-Zell-Linien aus anderen Zuchtlinien gefördert werden. TCGF können auch von anderen Stämmen von Ratten vorbereitet werden.
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PBS, 1x, sterile | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-182 | |
Penicillin / Streptomycin 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | P0781 | Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS |
Cell strainer, 70 um diameter | Tool | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Reagent | Sigma-Aldrich | A0171 | Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold |
RPMI 1640 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 21870-092 | |
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | Heat-inactivated |
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine | Reagent | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | PSG |
RPMI vitamins, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | R7256 | |
Sodium pyruvate, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | S8636 | |
Non-essential amino acids, 100x | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
Beta-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7522 | |
alpha methyl mannoside | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
Concanavalin A | Reagent | Sigma-Aldrich | M6882 | |
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercapt–thanol; 2 ug/ml Concanavalin A. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).