Мы описываем подготовки Т-клеток фактор роста для в пробирке расширения антиген-специфических Т-лимфоцитов крыс линии.
Abstract
Поддержание антиген-специфических Т-клеток линий или клонов в культуре требует раундов антиген-индуцированной активации разделенных фаз клеточного 1,2 экспансии. Добавление интерлейкина-2 в культуре средств массовой информации во время фазы расширения необходимо предотвратить гибель клеток и достаточно для поддержания краткосрочной линии Т-клеток, но было показано, что увеличение Th1 поляризации 3. Замена интерлейкин 2, Т-клеточный фактор роста (TCGF), который содержит смесь цитокинов является более эффективным, чем интерлейкина-2 в поддержании долгосрочной линии Т-клеток в пробирке 3. Более того, TCGF могут быть легко получены в больших количествах в лаборатории и намного дешевле, чем рекомбинантный интерлейкин 2.
Здесь мы покажем, как готовить TCGF от крыс спленоцитов супернатантах культуры. Для этой процедуры, жмем селезенки от наивных крыс Льюиса эвтаназии для тимуса и сбора крови. Мы готовим одноклеточных суспензий из селезенки, лизировать эритроциты от осмотического шока, и семян спленоцитов в культуральной среде. Клетки стимулировали конканавалин, митоген, что не-выборочно активирует все лимфоцитов крыс T, вызывая продукцию цитокинов. Культуры supernantant собирается через 48 часов andexcess конканавалин связан с альфа-метил mannoside, чтобы предотвратить его активации Т клеточных линий на которых TCGF будет добавлен. TCGF затем стерильно фильтруют, аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.
Protocol
Возьмите Льюис крысы селезенки (крысы между 160-200г лучше). Dilacerate на льду в чашке Петри содержащие PBS + антибиотики (PBS-ПС) с использованием ячейки фильтра. Положить в 50 мл трубки. Залейте PBS-PS. Спиновые течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Вымойте клетки в два раза. Ресуспендиру?…
Discussion
Мы готовим TCGF из спленоцитов крыс Льюиса, так как мы регулярно эвтаназии наивные крыс от этого штамма для сбора сыворотки и thymi стимулировать Льюис крыс линии Т-клеток в пробирке. Это TCGF может быть использована для поощрения роста и выживания Т клеточных линий из других штаммов крысы. TCGF также могу?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.