Summary
B7-H1 (पी.डी. L1) और उसके PD-1 के लिए बाध्य एक प्रमुख ट्यूमर प्रेरित ट्यूमर microenvironment में immunosuppressive संकेत प्रदान करते हैं. एक immunohistochemical धुंधला अभिव्यक्ति और अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता में B7-H1 का स्थानीयकरण विशेषताएँ तकनीक वर्णित है यहाँ.
Protocol
B7-H1/PD-L1, प्रतिरक्षा विनियामक सेल सतह प्रोटीन की B7 परिवार के एक सदस्य, रिसेप्टर के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नकारात्मक विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्रमादेशित मौत एक (पीडी -1) 1,2. B7-H1 के ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा Overexpression मेलेनोमा, glioblastoma, फेफड़े, स्तन, बृहदान्त्र, अंडाशय, और गुर्दे की कोशिकाओं के carcinomas सहित मानव कैंसर के एक नंबर में उल्लेख किया गया है, और विरोधी ट्यूमर ख़राब करने के लिए दिखाया गया है टी सेल उन्मुक्ति 3-8.
हाल ही में, अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ऊतकों द्वारा अभिव्यक्ति B7-H1 एक संभावित शकुन 9,10 मार्कर के रूप में पहचान की गई है. इसके अतिरिक्त, अग्नाशय के कैंसर की एक माउस मॉडल में B7-H1 की नाकाबंदी करने के लिए एक विरोधी ट्यूमर 11 प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है. B7-H1 के इन आंकड़ों को एक संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्य के रूप में महत्व का सुझाव देते हैं. विरोधी B7-H1 नाकाबंदी एंटीबॉडी इसलिए में कई मानव के लिए कर रहे हैं में नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया जा रहा हैमेलेनोमा और फेफड़े, पेट, गुर्दे, पेट, और 12 अग्न्याशय के कैंसर सहित ठोस ट्यूमर.
आदेश में अंततः लिए रोगियों जो उपचारों लक्ष्यीकरण B7-H1 से लाभ होगा की पहचान करने में सक्षम होने के लिए, यह B7-H1 B7-H1 नाकाबंदी एंटीबॉडी के साथ इलाज के लिए रोगी प्रतिक्रिया की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के बीच संबंध की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. Immunohistochemistry के माध्यम से मानव अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ऊतकों में B7-H1 की अभिव्यक्ति की जांच कैसे इस संकेतन सह निरोधात्मक अणु ट्यूमर microenvironment में अर्बुदरोधी उन्मुक्ति का दमन करने के लिए योगदान देता है की एक बेहतर समझ दे देंगे. विरोधी B7-H1 मोनोक्लोनल (5H1 क्लोन) एंटीबॉडी चेन और सहकर्मियों द्वारा विकसित मानव neoplastic 4,8 ऊतकों के कई प्रकार के cryosections में विश्वसनीय धुंधला हो परिणामों का उत्पादन करने के लिए किया गया है दिखाया गया है, लेकिन आयल एम्बेडेड स्लाइड पर धुंधला हो जाना एक चुनौती गया था जब तक हाल ही में 13-18. B7-H1 staini विकसितअग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ऊतकों की आयल - एम्बेडेड स्लाइड्स के लिए एनजी प्रोटोकॉल. B7-H1 धुंधला हो जाना यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल छोटी सी पृष्ठभूमि के साथ लगातार B7-H1 के झिल्लीदार और cytoplasmic धुंधला हो पैदा करता है.
1. De-parafinization
- सेंकना 20 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड.
- एक रासायनिक हुड में, 10 मिनट के लिए विसर्जित xylene में स्लाइड.
- 10 मिनट के लिए ताजा xylene में विसर्जित स्लाइड.
- विसर्जित 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड.
- 5 मिनट के लिए नए सिरे से 100% इथेनॉल में विसर्जित स्लाइड.
- विसर्जित 5 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड.
- विसर्जित 5 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में स्लाइड.
- 5 मिनट के लिए विआयनीकृत जल में विसर्जित स्लाइड.
2. एंटीजन रिट्रीवल
- Tris - EDTA (9.0 पीएच) बफर और एक प्रेशर कुकर में गर्मी 125 ° 30 सेकंड के लिए सी, तो 90 ° 10 सेकंड के लिए सी में विसर्जित स्लाइड.
- स्लाइड 60 मिनट के लिए शांत करते हैं.
- 5 मिनट के लिए TBST में विसर्जित स्लाइड्स, repeदो बार.
3. धुंधला हो जाना
- स्लाइड पर ऊतक के आसपास समाधान साफ कर लें. मार्क एक hydrophobic कलम के साथ ऊतक के चारों ओर एक घेरे.
- आर्द्रता चैम्बर में स्लाइड्स प्लेस और पूरे धुंधला प्रक्रिया में स्लाइड पर ऊतक सुखाने की से बचें. जगह peroxidase ब्लॉक के 5 मिनट के लिए स्लाइड और सेते स्लाइड्स peroxidase ब्लॉक में hydrophobic सर्कल के भीतर एक (लगभग 200 μl या अधिक ऊतक क्षेत्र पूरी तरह से कवर) ड्रॉप.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह.
- जगह ब्लॉक ऐस की एक बूंद और प्रत्येक 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर बफर अवरुद्ध.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह.
- जगह एक और 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर एक avidin समाधान के ड्रॉप.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह.
- प्लेस और 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर एक बायोटिन समाधान के ड्रॉप.
- Sli कुल्लाdes TBST साथ, 5 मिनट के लिए तो TBST में जगह.
- विरोधी B7-H1 माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 1:1,000 कमजोर पड़ने (5H1 क्लोन) या एक IgG1 माउस के साथ स्लाइड्स सेते κ 200 μl TBST में 4 निर्धारण पर नियंत्रण ° C 22 घंटे + / - 1 घंटे के लिए रातोंरात. में अंतिम एंटीबॉडी एकाग्रता TBST 2.57 छ / मिलीलीटर है.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह. दो बार दोहराएँ.
- एक बायोटिन संयुग्मित विरोधी माउस चूहा IgG1 एक 1:500 एकाग्रता पर 30 मिनट के लिए माध्यमिक (200 μl 2% बकरी सीरम समाधान) एंटीबॉडी के साथ स्लाइड सेते हैं.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह. दो बार दोहराएँ.
- प्लेस streptavidin बायोटिन परिसर की एक बूंद और प्रत्येक 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर (कम से कम 30 मिनट का उपयोग करने के पूर्व तैयार होना चाहिए).
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह. दो बार दोहराएँ.
- प्लेस प्रवर्धन अभिकर्मक का एक और 4 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर ड्रॉप (TBST साथ पतला 02:01).
- टी के साथ स्लाइड कुल्लाBST, 5 मिनट के लिए तो TBST में जगह. दो बार दोहराएँ.
- प्लेस और 15 मिनट के लिए स्लाइड सेते पर एक streptavidin - एचआरपी के ड्रॉप.
- TBST साथ स्लाइड्स कुल्ला, फिर 5 मिनट के लिए TBST में जगह. दो बार दोहराएँ.
- 3,3 Diaminobenzidine की एक बूंद (थपका) सब्सट्रेट और प्रत्येक स्लाइड पर वर्णकोत्पादक प्लेस और 2 मिनट के लिए रंग का विकास.
- रंग विकास के तुरंत बाद, DDH 2 हे के साथ 1-2 मिनट के लिए स्लाइड्स धो लो.
- 90 सेकंड के लिए एक hematoxylin की बूंद के साथ स्लाइड्स सेते हैं.
- DDH 2 हे के साथ 1-2 मिनट के लिए धो लें.
- 1-2 मिनट के लिए साबुन का नल के पानी से धो लें.
- DDH 2 हे के साथ 1-2 मिनट के लिए धो लें.
4. निर्जलीकरण और बढ़ते
- 3 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया.
- 3 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया.
- 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड को विसर्जित कर दिया. दोहराएँ.
- Xylene में 5 मिनट के लिए स्लाइड्स को विसर्जित कर दिया. दोहराएँ.
- एक बूंद जोड़ेंस्लाइड और जगह coverslip 60 Cytoseal.
तालिका 1 ऊपर वर्णित प्रक्रिया में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों की सूची है.
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Representative Results
B7-H1 का एक सफल immunohistochemical धुंधला हो अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता में B7 H1 (भूरे रंग के संकेतों को थपका रंग विकास) की विषम अभिव्यक्ति प्रदर्शन करेंगे. कुछ अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं B7-H1 के मुख्य रूप से झिल्लीदार अभिव्यक्ति (चित्रा 1 ए) है जबकि दूसरों को या तो मुख्य रूप से cytoplasmic B7-H1 या B7 H1 (2 आंकड़े और 3) के छोटे अभिव्यक्ति की अभिव्यक्ति है. सामान्य अग्नाशय वाहिनी उपकला थोड़ा B7-H1 (4 चित्रा) को व्यक्त करता है. बजाय एक माउस IgG1 κ निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना विरोधी B7-H1 एंटीबॉडी का थोड़ा पृष्ठभूमि धुंधला हो जाना (चित्रा 1B) से पता चलता है.
चित्रा 1. ए विरोधी B7-H1 साथ immunohistochemical धुंधला हो जाना, क्लोन 5H1 प्रतिरक्षी कुछ अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं पर झिल्लीदार अभिव्यक्ति से पता चलता है बी. Immunohistoc.निर्धारण IgG1 नियंत्रण के साथ hemical धुंधला हो उसी अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ऊतक पर थोड़ा थपका रंग विकास से पता चलता है.
चित्रा 2 अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं के cytoplasm में B7-H1 अभिव्यक्ति.
चित्रा 3. कुछ अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं B7-H1 थोड़ा व्यक्त करते हैं.
चित्रा 4 सामान्य अग्नाशय ductal उपकला पर B7-H1 अभिव्यक्ति.
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Discussion
B7-H1 cryosections पर immunohistochemical धुंधला हो जाना 3,4 के कैंसर के एक किस्म के लिए पूर्व अध्ययन की रिपोर्ट में किया गया है. हालांकि, नैदानिक ट्यूमर के नमूनों आमतौर पर आयल - एम्बेडेड ब्लॉकों के रूप में ही उपलब्ध हैं. 5H1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अधिक हाल ही में सफलतापूर्वक आयल एम्बेडेड वृक्क कोशिका कार्सिनोमा, ग्रीवा कार्सिनोमा, मूत्राशय कैंसर और 13-18 मेलेनोमा सहित ट्यूमर ऊतकों के धुंधला करने के लिए लागू किया गया है. B7-H1 9,19 आयल - एम्बेडेड या cryostat अन्य मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ ग्रंथिकर्कटता अग्नाशय के ऊतकों के 20 वर्गों पर धुंधला हो जाना भी सूचित कर दिया गया है. यहाँ, हम B7-H1 5H1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ आयल एम्बेडेड अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता ऊतकों के सफल धुंधला हो जाना दिखाया गया है. अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता में B7-H1 की अभिव्यक्ति विषम, 4,21 मेलेनोमा के रूप में दुर्दमताओं के कई अन्य प्रकार के लिए इसी तरह की है. दोनों झिल्लीदार और B7-H1 गिरफ्तारी के cytoplasmic अभिव्यक्तिई ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (आंकड़े 1 और 2) के साथ मनाया. B7-H1 के झिल्लीदार अभिव्यक्ति अपनी जैविक समारोह के साथ संगत है. B7-H1 cytoplasmic neoplastic ऊतकों में भूमिका के लिए लगाया जाना रहता है. सामान्य अग्नाशयी नलिका उपकला या कोष्ठकी कोशिकाओं B7-H1 व्यक्त नहीं (4 चित्रा).
इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों कमरे के तापमान पर जगह ले, 4 डिग्री सेल्सियस में रातोंरात ऊष्मायन के लिए छोड़कर एंटीजन पुनर्प्राप्ति इस B7-H1 धुंधला हो जाना प्रक्रिया में इस्तेमाल की स्थिति में aforementioned प्रकाशनों 9,19 नहीं सूचित किया गया. प्रवर्धन कदम भी इन अध्ययनों द्वारा नियोजित नहीं किया गया था. हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम प्रतिजन पुनर्प्राप्ति, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रातोंरात ऊष्मायन, प्रवर्धन, और थपका रंग विकास शामिल हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए थोड़ा 5H1 से प्रत्येक अलग बैच के लिए titrated की आवश्यकता हो सकती है. प्रवर्धन 4 मिनट पर किया गया है वास्तव में रखा के साथएक पतला प्रवर्धन अभिकर्मक. इन संशोधनों पृष्ठभूमि में वृद्धि के बिना सकारात्मक संकेतों के पर्याप्त प्रवर्धन दे. विकास के समय आम तौर पर 2 मिनट है, लेकिन हम नियमित न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ इष्टतम धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के तहत विकास की निगरानी. धुंधला हो जाना के प्रत्येक दौर के साथ, हम पिछले एक बैच में से एक स्लाइड और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में tonsil ऊतक के एक स्लाइड शामिल हैं. Tonsil में B7-H1 के Paracortical धुंधला हो जाना पहले किया गया है 4 में वर्णित है. यदि पृष्ठभूमि है या अगर यह इन नियंत्रण स्लाइड में विशिष्ट संकेतों को विकसित करने के लिए अधिक से अधिक 5 मिनट लगते हैं, हम महत्वपूर्ण कदम के लिए अभिकर्मकों जगह और सब धुंधला हो जाना कदम की जाँच करने की सलाह देते हैं.
इस धुंधला हो जाना तकनीक के उपयोग B7-H1 अभिव्यक्ति और neoplastic अग्नाशय ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं पर स्थानीयकरण के गुणात्मक और अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. प्राथमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के संशोधन, लंबाई amplificati के और कमजोर पड़ने के साथकदम है, और रंग के विकास के समय पर, इस प्रोटोकॉल के अन्य प्रकार के ऊतक को लागू किया जा सकता है. हम इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया है और यह स्तन कैंसर और सार्कोमा ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया. B7-H1 और PD-1 एक प्रमुख ट्यूमर प्रेरित ट्यूमर microenvironment में immunosuppressive संकेत प्रदान बाध्यकारी के रूप में, यह धुंधला हो जाना तकनीक ट्यूमर दीक्षा, प्रगति और विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में ट्यूमर microenvironment की भूमिका के बारे में हमारी समझ को सुविधा होगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
EB, KMB, सेमी और समान रूप से योगदान करते हैं. इस अध्ययन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल CA062924 P50 कैंसर, NIH CA148964 K23, Lustgarten फाउंडेशन, Viragh फाउंडेशन, ASCO युवा अन्वेषक पुरस्कार, NIH CA0090701-28 प्रशिक्षण अनुदान, सोल गोल्डमैन अग्नाशय के कैंसर केंद्र, और राष्ट्रीय अग्न्याशय फाउंडेशन 5T32 में NCI बीजाणु द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
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