Summary
B7-H1 (PD-L1) et sa liaison au PD-1 fournissent une importante induite par la tumeur de signal immunosuppresseur dans le micro de la tumeur. Une technique de coloration immunohistochimique pour caractériser l'expression et la localisation de B7-H1 dans l'adénocarcinome pancréatique est décrite ici.
Abstract
B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l'ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire.
Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l'importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l'objet d'essais cliniques pour le mulsieurs tumeurs solides humaines, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l'estomac et du pancréas 12.
Pour finalement être en mesure d'identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d'étudier la corrélation entre l'expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l'expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l'immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L'anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons devenfuie le protocole de coloration B7-H1 pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière.
Protocol
B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l'ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire.
Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l'importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l'objet d'essais cliniques pour l'homme multipledes tumeurs solides, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l'estomac et du pancréas 12.
Pour finalement être en mesure d'identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d'étudier la corrélation entre l'expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l'expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l'immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L'anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons développé le staini B7-H1protocole ng pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière.
1. De-parafinization
- Cuire glisse à 55 ° C pendant 20 min.
- Dans une hotte chimique, immerger les lames dans du xylène pendant 10 min.
- Immerger les lames dans du xylène frais pendant 10 min.
- Plonger les lames dans de l'éthanol à 100% pendant 5 min.
- Plonger les lames dans de l'éthanol 100% frais pendant 5 min.
- Plonger les lames dans de l'éthanol à 95% pendant 5 min.
- Plonger les lames dans l'éthanol à 80% pendant 5 min.
- Plonger les lames dans de l'eau désionisée pendant 5 min.
2. Récupération antigène
- Immerger les lames dans du Tris-EDTA (pH 9,0) et de la chaleur dans une cocotte-minute à 125 ° C pendant 30 secondes, puis 90 ° C pendant 10 sec.
- Laissez refroidir diapositives pendant 60 min.
- Immerger les lames dans du TBST pendant 5 min; Repemoins deux fois.
3. Tachant
- Essuyez solutions autour du tissu sur les diapositives. Marquer un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe.
- Placer les lames dans une chambre humide et éviter le séchage du tissu sur la lame pendant le processus de coloration entier. Déposer une goutte (environ 200 pi ou plus pour couvrir complètement la zone de tissu) du bloc de peroxydase dans le cercle hydrophobe sur la diapositive et diapositives incuber dans le bloc peroxydase pendant 5 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
- Déposer une goutte de BLOCK ACE tampon de blocage sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
- Déposer une goutte de solution d'avidine sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
- Déposer une goutte de solution de biotine sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
- Rincer slides avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min.
- Incuber les lames avec 1:1000 dilution des anticorps de souris anti-B7-H1 anticorps monoclonal (clone 5H1) ou une souris IgG1 κ isotype contrôle dans 200 ul TBST à 4 ° C pendant la nuit pendant 22 heures + / - 1 heure. La concentration finale de l'anticorps dans du TBST vaut 2.57 pg / ml.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Incuber les lames avec un rat biotine anti-souris conjugué anticorps IgG1 secondaire à une concentration 1:500 (dans 200 ul solution de chèvre 2% de sérum) pendant 30 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Déposer une goutte de streptavidine-biotine (doit être préparé au moins 30 minutes avant de l'utiliser) sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Déposer une goutte de réactif d'amplification (dilué 2:1 avec du TBST) sur chaque lame et incuber pendant 4 min.
- Rincer les lames avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Déposer une goutte de streptavidine-HRP sur chaque lame et incuber pendant 15 min.
- Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois.
- Déposer une goutte de 3,3-diaminobenzidine (DAB) et substrat chromogène sur chaque diapositive et développer la couleur pendant 2 min.
- Immédiatement après le développement de la couleur, laver les lames avec ddH 2 O pendant 1-2 min.
- Incuber les lames avec une goutte d'hématoxyline pendant 90 sec.
- Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min.
- Laver à l'eau savonneuse robinet pendant 1-2 min.
- Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min.
4. La déshydratation et de montage
- Immerger les lames dans l'éthanol à 80% pendant 3 min.
- Immerger les lames dans l'éthanol à 95% pendant 3 min.
- Immerger les lames dans l'éthanol à 100% pendant 5 min. Répéter.
- Immerger les lames dans du xylène pendant 5 min. Répéter.
- Ajouter une goutte deCytoseal 60 à la lame et le lieu de la lamelle.
Le tableau 1 dresse la liste des réactifs utilisés dans les procédures décrites ci-dessus.
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Representative Results
Une coloration immunohistochimique succès de B7-H1 fera la démonstration de l'expression hétérogène de B7-H1 (brun signaux développement de la couleur DAB) dans l'adénocarcinome du pancréas. Certaines cellules d'adénocarcinome du pancréas ont une expression essentiellement membranaire de B7-H1 (figure 1A) tandis que d'autres ont une expression soit essentiellement cytoplasmique de B7-H1 ou peu d'expression de B7-H1 (figures 2 et 3). Épithélium pancréatique normal conduit exprime peu B7-H1 (figure 4). La coloration avec un anticorps IgG1 de souris κ contrôle isotypique au lieu de l'anticorps anti-B7-H1 montre peu de bruit de fond (figure 1B).
Figure 1. A. La coloration immunohistochimique avec l'anticorps anti-B7-H1, clone d'anticorps 5H1 montre l'expression membranaire des cellules d'adénocarcinome du pancréas certains. B. Immunohistoccoloration CHIMIQUE avec le contrôle isotypique IgG1 montre peu de développement de la couleur DAB sur le tissu même adénocarcinome pancréatique.
Figure 2. B7-H1 expression dans le cytoplasme de cellules d'adénocarcinome du pancréas.
Figure 3. Certaines cellules d'adénocarcinome du pancréas expriment peu B7-H1.
Figure 4. B7-H1 expression sur l'épithélium canalaire pancréatique normal.
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Discussion
La coloration immunohistochimique de B7-H1 sur cryocoupes a été rapporté dans les études antérieures pour une variété de cancers 3,4. Cependant, cliniques échantillons tumoraux sont généralement disponibles que sous la forme de blocs de paraffine. L'anticorps monoclonal 5H1 a plus récemment été appliquée avec succès à la coloration des tissus tumoraux inclus en paraffine y compris le carcinome à cellules rénales, cancer du col, cancer de la vessie et le mélanome 13-18. B7-H1 taches sur la paraffine ou 9,19 cryostat 20 sections de tissus adénocarcinome pancréatique avec d'autres anticorps monoclonaux ont également été rapportés. Ici, nous avons montré une coloration réussie de tissus inclus en paraffine adénocarcinome pancréatique avec l'anticorps monoclonal 5H1 à B7-H1. L'expression de B7-H1 dans l'adénocarcinome pancréatique est hétérogène, semblable à celle de nombreux autres types de tumeurs malignes telles que le mélanome 4,21. L'expression membranaire et cytoplasmique fois de B7-H1 are observée avec les cellules d'adénocarcinome (figures 1 et 2). L'expression membranaire de B7-H1 est compatible avec sa fonction biologique. Le rôle des cytoplasmique B7-H1 dans les tissus néoplasiques reste à explorer. Normales du canal pancréatique des cellules épithéliales acineuses ou n'expriment pas B7-H1 (figure 4).
Toutes les étapes de ce protocole ont lieu à la température ambiante, à l'exception de l'incubation d'une nuit à 4 ° C. Conditions d'extraction des antigènes utilisés dans cette procédure de coloration B7-H1 n'ont pas été signalés dans ce qui précède publications 9,19. L'étape d'amplification a également été pas employé par ces études. Nous avons constaté que les étapes critiques de ce protocole incluent la récupération d'antigène, la nuit d'incubation avec l'anticorps primaire, l'amplification et le développement de la couleur DAB. La dilution de l'anticorps primaire peut-être besoin d'être titrée légèrement différent pour chaque lot de 5H1. Amplification a été maintenu exactement à 4 minun réactif d'amplification dilué. Ces modifications donnent une amplification suffisante des signaux positifs sans augmenter arrière-plan. Le temps de développement est généralement de 2 min, mais nous avons l'habitude de suivre l'évolution sous un microscope afin d'assurer une coloration optimale avec un minimum d'arrière-plan. À chaque cycle de coloration, nous incluons une diapositive à partir d'un lot précédent et une lame de tissu amygdalien comme contrôles positifs. Paracorticale coloration de B7-H1 dans les amygdales a été décrit précédemment 4. Si le fond est élevé ou si cela prend plus de 5 minutes pour développer des signaux typiques dans ces lames de contrôle, nous recommandons de remplacer les réactifs pour les étapes critiques et vérifier toutes les étapes de coloration.
L'utilisation de cette technique de coloration permettent une analyse qualitative et semi-quantitative de B7-H1 expression et la localisation sur néoplasiques des cellules d'adénocarcinome du pancréas. Avec la modification de la dilution de l'anticorps primaire, la longueur et la dilution de la amplificatià l'étape, et le temps de développement de la couleur, ce protocole peut être appliqué à d'autres types de tissus. Nous avons modifié ce protocole et l'a utilisé pour le cancer du sein et des tissus sarcome. Comme B7-H1 et sa liaison au PD-1 fournissent une importante induite par la tumeur de signal immunosuppresseur dans le micro de la tumeur, cette technique de coloration facilitera notre compréhension du rôle du microenvironnement de la tumeur dans l'initiation de la tumeur, la progression et anti-tumorale réponse immunitaire.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
EB, KMB, et HX contribuent à parts égales. Cette étude a été financée par le NCI SPORE de cancers gastro-intestinaux P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Fondation, le Prix du jeune chercheur ASCO, NIH 5T32 CA0090701-28 Subvention de formation, Sol Goldman Centre cancer du pancréas, de la Fondation nationale du pancréas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CSA System | Dako | K1500 | Includes the following reagents mentioned in the protocol: peroxidase block, streptavidin-biotin complex, amplification reagent, streptavidin-HRP, and DAB substrate and chromogen |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| Biotin anti-mouse IgG1 | BD | 553441 | |
| Mouse IgG1 K Isotype Control | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS(Tris-buffered saline), 10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS contains 80 g/L NaCl and 24.2 g/L Tirs; Diluted to 1X with ddH2O for washes; |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 1 ml added to 1 L of 1X TBS to make TBST |
| Target Retrieval, 20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | Diluted to 1x with ddH2O |
| 190 Proof Ethyl Alcohol | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 Proof Ethyl Alcohol | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| Xylene | VWR | 95057-827 | |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Coverslips | Corning | 2940-245 | |
| Humidity chamber | Sigma | H6644 | |
| Table 1. Reagents and equipment. | |||
References
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
- Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
- Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
- Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
- Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
- Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
- Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
- Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
- Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
- Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
- Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
- Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
- Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
- Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
- Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
- Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
- Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
- Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
- Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
- Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37 (2012).
