Summary
Vi beskriver en integrert metode for den presise, stereotactic Implantering av humant glioblastoma multiforme celler i hjernen på nakne mus og etterfølgende serienummer
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) er en høyverdig primære kreft i hjernen med en median overlevelse på bare 14,6 måneder hos mennesker tross standard tri-modalitet behandling bestående av kirurgisk reseksjon, postoperativ strålebehandling og Temozolomide kjemoterapi en. Nye terapeutiske tilnærminger er klart behov for å forbedre pasientens overlevelse og livskvalitet. Utviklingen av mer effektive behandlingsstrategier ville bli hjulpet av dyremodeller av GBM som rekapitulere sykdom hos mennesker, men la seriell imaging å overvåke svulsten vekst og behandlingsrespons. I denne artikkelen beskriver vi vår teknikk for nøyaktig stereotactic implantasjon av bio-bildeområdet GBM kreftceller i hjernen på nakne mus som resulterer i tumorxenotransplantater som rekapitulere viktige kliniske funksjoner i GBM 2. Denne metoden gir svulster som er reproduserbare og er lokalisert i presise anatomiske steder samtidig som in vivo bioluminescent imaging til serielt overvåke intrakranial xenograft vekst og respons til behandlinger 3-5. Denne metoden er også godt tolerert av dyr med lav perioperativ morbiditet og mortalitet.
Protocol
A. preoperativ Tumor Cell Forberedelse
- Transduce U251 glioblastoma multiforme celler med en lentiviral uttrykk vektor (pGreenFire, System biovitenskap) til stabilt uttrykke firefly luciferase genet.
- Disse cellene ble dyrket i 10 ml komplett Dulbeccos Modifikasjon av Eagles medium (DMEM), som består av DMEM supplert med 10% føtalt kalveserum, 1% penicillin-streptomycin, og 1% ikke-essensielle aminosyrer i en T75 vevskultur kolbe inkubering ved 5% C0 2 og 37 ° C.
- Utfør standard cellekultur, som begynner med vasking av cellene med fosfatbufret saltvann (PBS), etterfulgt av trypsinizing.
- Slukke trypsin med komplett DMEM, overføre løsningen til en 50 ml konisk kolbe og bestemme cellulære konsentrasjonen med Coulter Counter.
- Sentrifuger de høstede celler i komplett DMEM i 3 min ved omtrent 3000 omdreininger pr minutt.
- Etter sentrifugering aspirer avf mediene slik at bare en pellet av celler på bunnen av den 50 ml konisk kolbe.
- Arbeider raskt for å hindre at cellene fra uttørking, resuspendere cellene i et volum av fersk komplett DMEM å oppnå den ønskede konsentrasjon av 50.000 celler / mikroliter og overføre til en 2 ml steril hetteglass anbragt på is.
- Celler på is bør kort virvlet på en lav innstilling hver ~ 20 min for å hindre celleadhesjon. Celler kan trygt brukes for intrakraniale implantasjoner opptil to timer etter plassering på is.
B. Orthotopic xenograft Implantasjon
- Vei naken atymiske NCR mus (nu / nu) å etablere en basislinje, pre-implantasjon vekt. Vi velger vanligvis mus 6-10 ukers alder med vekter mellom 17 og 24 gram.
- 1 hr før implantering, pre-medisinere mus med 5 mg / kg av ikke-steroide anti-inflammatorisk medikament meloksikam via subkutan injeksjon som en behandling for post-operativ smerte og inflammasjon.
- Anesthetize dyret med en intraperitoneal injeksjon av en ketamin / xylazin blanding i en dose på 140 mg / kg og 10 mg / kg henholdsvis.
- Bekrefter at musen er tilstrekkelig bedøvet ved å vurdere dyrets spontane reaksjon på en tå klype. Hvis dyret reagerer på tå knipe, forsinke prosedyren inntil anestesi kan tre i kraft eller vurdere injisere ytterligere anestesi (<25% av den opprinnelige mengde).
- Forbered bedøvet mus for posisjonering i Stoelting Digital Just for Mouse Stereotactic plattform (Stoelting Inc.) ved å hekte musens fortennene i bite bar snuten restrainer og stramme nesen tang over snuten samtidig som musen hode er på et nivå flyet.
- Overfør beherskede musen til Stoelting stereotactic plattformen, justere plasseringen av dyret slik at spissene av øret stolpene er på caudale enden av øregangen. Når dyrets cranial til caudal posisjonering har vært justeted, sikre bite bar til stereotactic rammen. Musen skal hvile på et fast plast varmeplate (Harvard Apparatus) sikret med tape til Stoelting plattform for å gi tilbakemelding styrt temperaturregulering under operasjonen.
- Juster høyden på øret barer som nødvendig, og deretter fremme øret barer i Caudal delen av øregangen, sikre dem slik at mus hode er på et nivå flyet og immobilisert på fingeren touch. Overvåke nøye for tegn på pusteproblemer etter plassering av øret barer. Løsne og re-posisjon hvis dyret er i nød.
- Sett smurte spissen av en rektal temperatur sonde koblet til TCAT-2DF temperaturregulatoren (Harvard Apparatus) overvåke dyrets temperatur og for å gi tilbakemelding kontrollen til varmeplaten posisjonert under musen for å opprettholde dyrets kroppstemperatur ved 36 ° C under prosedyren.
- Påfør ophthalmic sårsalve for øyet å prevent tørking.
- Påfør Betadine løsning på toppen av musen hode for å desinfisere såret området, ta vare å unngå øynene.
- Utfør en tå klype for å bekrefte musen er bevisstløs, og leverer en liten mengde ekstra ketamin / xylazin (<25% av den opprinnelige dosen) om nødvendig.
- Rengjør 0,45 mm Burr drill bit (Stoelting) festet til drill (Foredom Microdrill) ved hjelp av en alkohol pad og deretter sterilisere borekronen i et glass perle sterilizer (500 Germinator, Cellpoint Scientific) i 15 sekunder, fordype bare boret inn sterilisatoren perler.
- Ved hjelp av en steril skalpell, gjør en 0,75 cm innsnitt i lengderetningen i midten hodebunnen som strekker seg fra nivået av øynene caudally. Bekreft visualisering av bregma.
- Fest drill holderen til Stoelting plattform og plassere en drill (Foredom Microdrill) med en 0,45 mm burr drill bit (Stoelting) i bore holder, sikre den i posisjon.
- Plasser boret rett over than bregma og deretter null-ut x, y, z-koordinater for det digitale stereotactic displayet. Flytt spissen av boret til en posisjon 2 mm posteriort og 1,5 mm lateralt i forhold til bregma i riktig cerebral halvkule og bore inn i dyrets skallen med Foredom drill, gjennomhulling bare benet. En steril bomullsdott kan brukes til forsiktig trekke kantene av innsnittet for å lette visualiseringen av skallen.
- Fjern boret og boret holderen fra stereotactic plattformen.
- Fest Nanomite injektoren sprøytepumpen (Harvard Apparatus) til stereotactic plattformen.
- Fjerne celler fra isen og enten forsiktig vortex hetteglasset som inneholder kreftceller med korte pulser eller knips forsiktig på hetteglasset for å re-suspendere cellene. Utarbeide 7 pl av cellesuspensjonen gjennom en 30 gauge 1 "lang flat skråkant nål festet til en 10 ul sprøyte (Hamilton sprøyte). Unngå store luftbobler i sprøyten. Kontrollere om det er noen luftbobler i den innledende 6 pl av fluidum which blir totalverdien volum injisert i mus. Små luftbobler i de resterende 1 pl er ikke noe problem. Unngå gjentatte draw-ups av cellesuspensjonen hvis mulig å minimere skade på cellene.
- Plasser den lastede sprøyten inn i sprøyten injektoren. Bruke en alkohol pad, fjerne enhver av cellesuspensjonen fluidet som vises på tuppen av nålen for å unngå kontaminering av innsnitt området med kreftceller som kan resultere i tumor som vokser i ekstrakraniell plass.
- Still injektoren pumpen å levere 6,0 pl med en hastighet på 0,5 ul / min. Den 1 ul cellesuspensjon er igjen i sprøyten etter implantering sikrer at luftboblene som ofte samle seg i sprøyten ikke injiseres i dyret. Injeksjon av luftbobler kan resultere i dødelig luftemboli.
- Advance kanylen inn graden hullet opprettholde nålen vinkelrett (90 grader) til skallen. Når nålen har krysset skallen, null ut coordinates på stereotactic digitalt display og deretter sakte fremme nålespissen over en periode på 4 min inntil den når en dybde på 2,5 mm. Nålen passerer gjennom cortex og deler av bakre hippocampus. X-, y, z koordinatene for stereotaktisk implantasjon ble valgt for å generere en sideveis plassert svulst innenfor cerebrale hemisfære samtidig unngå skade til kritiske strukturer i hjernen slik som thalamus og nærhet til ventriklene dermed redusere sannsynligheten for kimdannelse cerebrospinalvæsken med tumorceller som kan gi opphav til uønskede spinal svulster. En bakre plassering i forhold til bregma ble valgt for å redusere sannsynligheten for en stor, lokalavansert svulst ulcerating inn i bane. Pause med nålen i dypet i 2 min og deretter sette i gang implantasjon av celler.
- Under implanteringen, tørk skallen gjentatte ganger med en mikrokirurgisk svamp spyd for å fjerne enhver tumor-holdig væske som kan ha tilbakeløpskokt ut av velcrobånd hullet underimplantasjon. Unngå å forstyrre nålen med mikrokirurgisk svamp. Fjerne denne væsken skal redusere sannsynligheten for svulst som vokser i ekstrakraniell plass.
- Etter injeksjon er fullført, lar nålen i hjernen for ca 2 minutter og deretter sakte trekke nålen over en periode på 3-4 min.
- Løsne øret barer og snute restrainer og fjerne musen fra stereotactic apparatet.
- Lukk velcrobånd hull i skallen med sterilt bein voks avsatt ved å gni voks og tilbake over graden hullet fra tre enden av en steril bomull-tipped applikator. Fortsetter søker bein voks inntil hullet er helt forseglet og bein voks forsegler velcrobånd hullet er i flukt med den tilstøtende skallen.
- Re-omtrentlige kantene av innsnittet med sterile bomullspinner og beregnes veterinær vevslim å forsegle såret, ta vare å unngå lim eksponering dyrets øyne.
- Til slutt plasserer musen på en varmepute satt til 37 °C inntil dyret gjenvinner bevisstheten. Overfør dyret tilbake til sin opprinnelige bur når musen er våken og responsive.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) for å overvåke tumorvekst og respons på behandlingen
Kort bruksanvisning følger for bioluminescent imaging.
- Anesthetize mus tidligere implantert med tumor i et kammer med 2% isofluran og oksygen.
- Mens musene bedøves, injisere dem enten subkutant eller intraperitonealt med 60 pl D-luciferin kaliumsalt fortynnet i PBS til en konsentrasjon på 50 mg / ml.
- Slå på strømmen av anestesi til nesen kjegler i bioluminescent bildebehandling skanner og raskt overføre musene til skanneren plassere sine snuter i nesen kjegler.
- Posisjonere sorte skillelinjene mellom musene å begrense blødning av bioluminescent signal fra en svulst med høyt signal intensitet til en tilstøtende svulst med mye lavere signal.
- HjelpLiving Bilde programvare, ta hyppige serielle eksponeringer for en total varighet på inntil 30 minutter etter tidspunktet for injeksjon av D-luciferin. Vi favorisere sette Eksponeringstid til "Auto" for å begrense sannsynligheten for en under-eller overeksponert bilde. Ingen enkelt eksponering bør være> 5 min.
- Utfør gjenta bioluminescent bildebehandling med passende mellomrom. Serial ukentlig imaging er et rimelig alternativ for mange langsgående eksperimenter testing respons på behandlingen.
- Etter oppkjøpet av bilder, bruk levende bilde program for å analysere svulster ved å tegne en region av interesse (ROI) rundt hver svulst i hvert bilde kjøpt i bioluminescent bildebehandling økten. Påfør en andre, mindre område av interesse til den nedre flanke av hver mus i hvert bilde som bakgrunn region av interesse å korrigere bioluminescent signalet av svulsten basert på graden av bakgrunnen bioluminescent signalintensiteten. Vi foretrekker å bruke "Radiance"-innstilling i stedet "teller" som utgangverdier for bioluminescent signal.
- Eksportere ROI resultatene i Excel og bestemme den maksimale bakgrunn justert bioluminescent signal for hver mus.
- Gjenta bioluminescent bildebehandling som indikert for seriell overvåking av tumorvekst. I våre eksperimenter, utfører vi ukentlig BLI. Vi foretrekker å bestemme maksimal BLI signal for en gitt avbildning sesjon ved å ta hyppige eksponeringer over 5 - 30 min etter injeksjon av D-luciferin.
D. Representant Resultater
Dette stereotaktisk implantasjon teknikken er assosiert med en vellykket tumor-ta sats på 90-100% og med lav perioperativ dødelighet som vanligvis er mindre enn 5%. Risikoen for utilsiktede bivirkninger er også lavt med denne teknikken, inkludert slike komplikasjoner som seeding i ryggmargen fra kreftceller implantert inn i ventriklene, eller ekstrakraniell tumorvekst fra enten såing av snittet med kreftceller eller utilstrekkelig lukking av graden hull enllowing intrakranial svulst å utvide gjennom åpningen i skallen.
Ex vivo analyse av tumorxenotransplantater demonstrerte forventet områder av hypoksi, økt VEGF uttrykk, og nekrose. Fluorescerende mikroskopi for grønt fluorescerende protein (GFP) stabilt uttrykt av vår GBM cellelinje avslørte infiltrerende naturen av disse xenografter.
Figur 1 viser resultatene av en typisk vellykket stereotactic implantasjon av GBM celler inn i hjernen til en mus. Dette er en T2-vektet hjerne MR av en mus hjernen utføres med en 9,4 Tesla magnet 21 dager etter implantering med teknikken beskrevet her. Figur 1 viser et enkelt fokus svulst i den høyre hjernehalvdelen (formet i rosa) måle 19 mm 3 som lokaliserer til den nøyaktige koordinater implantasjonsstedet.
Figur 2 viser resultatene av bioluminescent avbildning ved hjelp techn iques beskrevet her for en gruppe av 10 mus med stereotactically implantert svulster som var jevnt stratifisert basert på maksimal bioluminescent signal intensitet for å få enten kranial bestråling (4 Gy x 4 daglige fraksjoner) eller ingen behandling i det hele tatt. I dette eksperimentet, viser bioluminescent imaging at strålebehandling hemmer proliferasjon av de implanterte tumorer, noe som resulterer i ingen økning i den detekterte bioluminescent signal, mens signalet vesentlig øker i mock-bestrålte kontroll svulster, grunnet ukontrollert proliferasjon av kreftceller.
Figur 1 (Video). Koronal MR deler av en mus hjernen inneholder en U251 glioblastoma multiforme svulst med kontur av svulsten volum (i rosa). Skanningen ble utført ved hjelp av en spin ekko T2 vektet protokoll på en 9,4 Tesla skanner. Klikk her for å se filmen .
re 2 "src =" / files/ftp_upload/4089/4089fig2.jpg "/>
Figur 2. 10 mus med stereotactically implanterte glioblastoma multiforme svulster ble behandlet med enten ekstern stråle strålebehandling til 16 Gy i 4 fraksjoner eller ingen behandling. Mus ble avbildet med bioluminescent imaging før behandling og ukentlig etter starten av behandlingen. Grafen presenterer relative Bioluminescens beregnet som median fold endring der foldendring er definert som forholdet mellom den aktuelle maksimale BLI verdi til forbehandling maksimal BLI verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for stereotactic implantasjon av kreftceller hos mus som er beskrevet i denne artikkelen genererer reproduserbart svulster som rimelig rekapitulere infiltrerende og rask vekst mønster av kliniske glioblastoma 2 multiforme, 6-8. Denne teknikken er spesielt godt egnet til eksperimenter stratifying mus jevnt til forskjellige behandlingsgrupper der reproduserbare svulster av sammenlignbar størrelse og biologiske egenskaper og i bestemte anatomiske steder er ønskelig. Stereotactic implantasjon av kreftceller ved hjelp av teknikkene vi beskriver bør være lett oppnåelig av de fleste translasjonelle forskningslaboratorier 7,9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, og Dr. Xiangsheng Xu for deres eksperthjelp. Vi erkjenner støtte fra Dr. Ann Kennedy. BCB ble støttet på Radiation Biology Training Grant C5T32CA009677. JFD ble støttet på Burroughs Wellcome Career Award for medisinske forskere (1.006.792). JLB ble støttet på Supers stipend (5 R25 CA140116-03). Vi ønsker å erkjenne Dr. Steve Hahn som oppmuntring og støtte har bidratt til å gjøre vår forskning mulig. Vi vil også gjerne takke University of Pennsylvania Nano-Bio Interface Center (NBIC) og Dr. Dennis Discher for oppmuntring og nyttige kommentarer. Vi erkjenner Small Animal Imaging Facility (Saif) ved University of Pennsylvania for bruk av deres MR og optisk / Bioluminescens kjernefasiliteter. Disse teknikkene ble utviklet som en del av prosjektene som ble støttet av National Institutes of Health (RC1 CA145075 og K08 NS076548-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic platform for mouse implantation |
| Ketamine/xylazine | Injectable anesthesia | ||
| Puralube Vet Ointment (ophthalmic) | Amazon.com | To prevent drying of the mouse's eyes | |
| drill holder for the stereotactic platform | Stoelting | 51681 | |
| Micromotor Electric Drill | Stoelting | 51449 | For drilling through the skull |
| .45 mm carbide drill bit | Stoelting | 514551 | |
| Sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Glass bead dry sterilizer (Germinator 500) | Braintree Scientific | GER-5287 | To sterilize metal surgical instruments |
| Mouse rectal probe | Braintree Scientific | RET-3-ISO | Compatible with the temperature controller |
| Temperature Controller (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Temperature controller to maintain animal's temperature during surgery |
| Small heating plate | Harvard Apparatus | 727617 | For use with temperature controller to warm mouse during surgery. The heating plate fits under the mouse on the stereotaxic platform. |
| Disposable Scalpels | BD Bard-Parker | 2015-11 | #10 scalpel |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | For injection of tumor cells |
| 30 gauge needles, 1" long, with flat point | Hamilton | Various | Must be compatible with the 10 μl syringe |
| Nanomite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704507 | Digital motorized syringe injector for stereotaxic device |
| Cellulose sterile surgical spear sponges | Ultracell | 40410 | To dry the surgical field |
| Bone wax | Ethicon | W31 | To seal the burr hole |
| Tissumend II synthetic absorbable tissue adhesive | Veterinary Products Laboratories | 3002931 | To seal the incision |
| Hot water pump with warming pad | Gaymar | TP-650 | Warms mice in post-operative period |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | Luciferin for bioluminescent imaging |
References
- Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Jacobs, V. L., Valdes, P. A., Hickey, W. F., De Leo, J. A. Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro. 3, e00063 (2011).
- Shelton, L. M. A novel pre-clinical in vivo mouse model for malignant brain tumor growth and invasion. J. Neurooncol. 99, 165-176 (2010).
- Brehar, F. M. The development of xenograft glioblastoma implants in nude mice brain. J. Med. Life. 1, 275-286 (2008).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Radaelli, E. Immunohistopathological and neuroimaging characterization of murine orthotopic xenograft models of glioblastoma multiforme recapitulating the most salient features of human disease. Histol. Histopathol. 24, 879-891 (2009).
- Baumann, B. C. Enhancing the efficacy of drug-loaded nanocarriers against brain tumors by targeted radiation therapy. , Submitted (2012).
- Baumann, B. C. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). Transl. Oncol. , Forthcoming (2012).
- Park, S. S. MicroPET/CT imaging of an orthotopic model of human glioblastoma multiforme and evaluation of pulsed low-dose irradiation. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 80, 885-892 (2011).
- Szentirmai, O. Noninvasive bioluminescence imaging of luciferase expressing intracranial U87 xenografts: correlation with magnetic resonance imaging determined tumor volume and longitudinal use in assessing tumor growth and antiangiogenic treatment effect. Neurosurgery. 58, 365-372 (2006).
- Dinca, E. B. Bioluminescence monitoring of intracranial glioblastoma xenograft: response to primary and salvage temozolomide therapy. J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).
