Summary
Neointimal hyperplasi är den främsta orsaken till stenos i arterialized vener. Vi föreslår ett nytt protokoll varigenom den högra yttre jugularvenen ympas med manschetten tekniken i den gemensamma halsartären i Sprague Dawley-råttor. Överlevnaden var 100% vid tidpunkten för avlivning.
Abstract
Neointimal hyperplasi är en de främsta orsakerna till stenos i arterialized vener som är av stor betydelse i arteriell koronar bypass-kirurgi, perifer arteriell bypass-kirurgi samt arteriovenösa fistlar. 1-5 den experimentella proceduren för ventransplantat däremellan i den gemensamma halsartären genom att använda manschetten-tekniken har använts i flera forskningsprojekt för att undersöka etiologi av neointimal hyperplasi och terapeutiska alternativ för att ta itu med det. 6-8 Manschetten hindrar fartyget anastomotisk ombyggnad och inducerar turbulens inom transplantatet och därmed utvecklingen av neointimal hyperplasi.
Använda den överlägsna cava ventransplantat är en etablerad liten djurmodell för venös arterialization experiment. 9-11 Denna nuvarande protokollet hänvisar till en etablerad halsvenen transplantat mellanliggande som först beskrivits av Zou et al. 9 samt andra. 12-14
För att förenkla förfarandet och minimera antalet experimentella behövs djur en detaljerad operation protokoll genom video utbildning presenteras. Denna video bör hjälpa nybörjare kirurgen att lära sig både manschetten-tekniken och ventransplantat däremellan. Härigenom har den högra yttre jugularvenen ympad i manschetten-teknik i den gemensamma halsartären av 21 Sprague Dawley-råttor kategoriseras i tre lika stora grupper som offrades på dag 21, 42 och 84, respektive. Noterbart inga donatordjur behövs eftersom auto-transplantationer utfördes. Överlevnaden var 100% vid tidpunkten för avlivning. Dessutom, var transplantatet patency ränta 60% under de första 10 manövrerade djur och 82% för de återstående 11 djuren. Blodflödet vid tidpunkten för avlivning var 8 ± 3 ml / min. Sammanfattningsvis detta kirurgiska protokoll avsevärt förenklar, optimerar och standardiserar denna complicated förfarande. Det ger nybörjare kirurger enkla steg-för-steg instruktion, förklarar eventuella fallgropar, vilket hjälper dem att få kunskap snabbt och undvika onödigt offer försöksdjur.
Protocol
1. Försöksdjur
- Skaffa en lokal etisk kommitté godkännande för alla experiment som ska utföras i enlighet med de FELASA djurskydd riktlinjer.
- Använd Sprague-Dawley tillgängliga att köpa från någon kommersiell uppfödare (t.ex. Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, Tyskland). Vi använde 21 djur uppdelade i tre grupper om 7 djur vardera som avlivades vid 3, 6 och 12 veckor efter operationen. Vid tidpunkten för köpet, måste djuren vara 12 veckors ålder och väger 250-300 g..
- Håll djuren klimat-kontrollerade rum med en omgivningstemperatur på 21 ° C, 60% relativ fuktighet och en 12-timmars ljus-mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten.
2. Anestesi och operativa Förberedelser
- Inducera generell anestesi med hjälp av en plexiglas låda ansluten till anestesiapparaten, inställd på en syre-flödeshastighet av 1 l / min, samt en förångare isofluoran wed 5% anestesigas.
- Bibehåll anestesi med isofluoran Vaporizer på 1,5% så snart de djupa sensoriska reflexer hos djuren undertrycks.
- Fäst råttorna i ryggläge på en kropp värmeplatta.
- Förbered drift regionen varje djur genom att ta bort dess päls med hårborttagning grädde, från käken vinkel ner till 2 cm under manubrium sterni.
- Förbered ett sterilt kirurgiskt fält genom att uppmärksamma det kirurgiska området, området framställd på djuret och den främre delen av kirurgen:
- Rengör bänk med ett desinfektionsmedel.
- Förbered snittet webbplatsen genom att använda flera tillämpningar av kirurgisk skrubba lösning (t.ex. klorhexidin och 70% isopropylalkohol). Applicera Klorhexidin först alkoholen andra och slutligen skrubba lösningen.
- Bär en disponibel kirurgiskt klänning och kirurgiska handskar, alternativt handskar examen som tidigare har tvättade wed en kirurgisk desinfektionsmedel.
- Använd sterila mikrokirurgi instrument i verksamheten förfarande.
- Använd en operation mikroskop (Wild Heerbrugg M650, Gais, Schweiz) i 10-20-faldig förstoring.
3. Anatomi
Figur 1 visar anatomi råttans nacke:
1a) Situs innan transektion av rätt sternocleidomastoideus.
1b) Situs efter transektion av rätt sternocleidomastoideus.
4. Manschett Förberedelser
Skär muddar i en längd av 3 mm för hand från ett plaströr (Portex, innerdiameter 0,75 mm, ytterdiameter 0,94 mm, Smiths Medical, UK). Dessa manschetter består av en rörformig manschett kroppen inklusive hela volymen av plaströret, och en manschett handtag bestående av hälften av manschetten volymen. Både manschetten kroppen och manschetten handtaget bör vara lika long.. Manschetten Handtaget är nödvändig för att manipulera manschetten under den kirurgiska proceduren. Efter manschetten träs över kärlet, är en mini Bulldog klämma placeras samtidigt på manschetten handtaget och kärlet, för att förhindra blödning, hålla manschetten i läge och säkerställa stabilitet.
5. Manschett Teknik
- Slip manschetten över fartyget.
- Omedelbart efteråt, Evert fartyget, dra det över utsidan av manschetten och fäst den med en 7-0 silke ligatur. På detta sätt är lumen manschetten täckt med endotel. Därefter, lyft det venösa transplantatet över manschetten kroppen och fäst den med en ny 7-0 silkesligatur. För att förhindra trombosbildning, är det viktigt att fästa slips ventransplantat mycket nära manschetten marginal för att undvika att blod kommer i kontakt med slips håller artären på plats. Detta är avgörande för den distala anastomosen grund av blodflödet riktning. Emellertid, enligt författarna, anses det inte varaväsentliga för den proximala anastomosen av samma anledning.
6. Kirurgisk procedur
6,1 Beredning av den högra yttre halsvenen
- Gör en ungefärlig 2,5 cm lång median livmoderhalscancer snitt direkt ovanför manubrium sterni.
- Fullständigt separera en 1 cm långt segment av den högra yttre jugularvenen från omgivande vävnader
- Ligera venösa tillflöden med 7-0 silkessuturer.
6,2 Beredning av den högra gemensamma halsartären
- Förbered sternocleidomastoideus och transekt den i mitten.
- Förbered högra gemensamma halsartären noggrant, och se till att inte komprimera artären eller vagusnerven. Mobilisera den från halspulsådern förgrening ner till brachiocephalic stammen.
- Därefter ligera två gånger i mitten med 7-0 silke suturer innan transektion.
- Lyft nylon manschett consisting av en kropp och ett handtag (fig. 2a) över den distala änden av den gemensamma halsartären, varvid det är viktigt att se till att manschetten handtaget är bakom kärlet (figur 2b).
- Kläm manschettförsett änden av den distala gemensamma karotisartären med en mini bulldogg klämma exakt på manschetten handtaget för att garantera stabilitet (figur 2c).
- Därefter, skär artären direkt bakom ligaturen, varigenom den resulterande arteriell stubben bör vara så lång som manschetten.
- Skölj den arteriella lumen med heparin-saltlösning (20 lU heparin / ml 0,9% NaCl). Ställ en ligering slinga undan i rätt position för senare användning.
- Dra arteriella stumpen upp och glida det som en hylsa över manschetten kroppen.
- Därefter drar ligerings slingan och knut ordentligt.
- För att förhindra artären glider ur sitt ärmen kan du genomföra ett trick: Ta tag i båda artärväggen och suturen med höger hand ärimultaneously och med vänstra pincett (Figur 2d) gör knut (figur 2e).
- Upprepa samma procedur för den proximala arteriella stumpen (Figur 2f).
6,3 Venös transplantat positionering
- Punktskatter en 1 cm lång segment av den fastklämda yttre halsvenen
- Eftersom de två cuffed artärerna är för långt ifrån varandra för venösa däremellan, ungefär rätt avstånd för detta förfarande med en 3-0 Vicryl-sutur som du bör slinga runt varje mini Bulldog klämma.
- Korsvis båda suturer.
- Därefter, dra suturerna i motsatta riktningar, så att korrekt positionering av de cuffed arteriella stubbar (figur 2g)
- Skölj vensegmentet med heparin-saltlösning.
- Slip ena änden av den tidigare vänt vensegmentet över kuffad distala halspulsådern och fäst den i rätt positiontion med en siden 7-0 ligatur.
- Det är viktigt att notera här att omkretsen av venen måste vara fullständigt och jämnt gripas.
- Skölj vensegmentet med heparin-saltlösning-lösning, och glida den andra änden av vensegmentet över den proximala stumpen halspulsådern.
- Fyll i ligering (figur 2h);
- Ta mini Bulldog klämmorna efter varandra, först på den distala halspulsådern stubbe och därefter på den proximala en, varigenom obehindrat blodflöde och arterialization av venösa transplantatet (figur 2i). Operationen anses framgångsrik om blodflödet och pulsering observeras inom transplantatet och den gemensamma halsartären (bedöms visuellt).
6,4. Sårtillslutning
För den subkutana kör sutur, använd 4-0 Vicryl. För en kutan kör sutur, använd 3-0 Vicryl.
7. Återvinning och postoperativ hantering </ P>
- Låt djuren återhämta sig från bedövning på en plan papper sängkläder under en infraröd uppvärmning lampa. Skicka inte tillbaka opererade djur till djur innehav området tills alla djur verkar normala.
- Postoperativt administrera Buprenorfin (Temgesic) i en koncentration av 0,03-0,05 mg / kg kroppsvikt SC var 8-12 timme under 2 dygn. Buprenorfin kan ges strax före isofluoran induktion.
- Övervaka djur postoperativt för deras allmäntillstånd och tecken på sjukdom eller infektion.
8. Blood Flow Measurement
Den postoperativa öppenhet av transplantatet bevisades genom blodflödet mätning med hjälp av en forsknings Transonic blodsystemet flödesmätning (Modell: TS420, Transonic Systems Europe BV, Maastricht, Nederländerna) med en perivaskulär flowprobe (3 mm MA3PSB). Systemet är baserat på Doppler-principen.
9. Representativa resultat
Av faithfully hålla instruktionerna ovan nämnda, var den genomsnittliga löptiden för kirurgiska ingrepp cirka 65 minuter. Djuren presenterade en utmärkt fysisk kondition och gick upp i vikt som förväntat i hela försöket: vid startpunkten drift djuren vägde 312 ± 20,39 g.. På bekostnad tidpunkten 3 veckor postoperativt djuren vägde 325,2 ± 28,7 g, vid 6 veckor 333 ± 39,9 g och vid 12 veckor 362,22 ± 29 g..
Inga infektioner observerades vid operationen platsen och inga utvecklade sår. Operationen såren läkte helt vid den förväntade tidpunkten. Den neurologiska kontrollen visade inga tecken på hjärninfarkt eller motoriska brist. Den senare en viktig punkt, eftersom djuren drivs i karotisartären och en av de två externa jugularvenerna avlägsnades och användes som auto-transplantation. Inga allergiska reaktioner på den postoperativa smärtlindring terapi observerades.
> Alla djur vaksam och social hela experimentet. Deras vanor för att ta emot mat och vatten oförändrad under hela tiden.
Överlevnadsgraden hos alla experiment var 100% vid tidpunkten för avlivning. Transplantatet öppenhet ränta var 60% för de första 10 opererade djur och därmed 82% för de återstående 11 djuren. Den totala transplantat öppenhet var 71%. Blodflödet i de arterialized venösa transplantaten mättes vid tidpunkten för avlivning och var 8 ± 3 ml / min utan några statistiskt signifikanta skillnader mellan de tre punkterna offra tid.
Figur 1. Anatomi råttans nacke. 1a) Situs innan transektion av rätt sternocleidomastoideus. 1b) Situs efter transektion av rätt sternocleidomastoideus.
. Figur 2 Intraoperativa mikroskopiska bilder: a) manschetten består av manschetten-kropp och manschetten-handtag, b) manschetten glida över den distala änden av den gemensamma halsartären, c) fastspänning av kuffad distala gemensamma karotisartären stubbe, d) eversion av gemensamma halspulsådern stubbe över manschetten, e) säkra vrängda gemensamma halspulsådern stubbe med en ligatur, f) situs efter eversion av både cuffed distala och proximala gemensamma halspulsådern stubbar, g) kors och tvärs teknik för tillnärmning av två handbojor gemensamma halsartären stubbar, h) situs efter venös mellanliggande, i) situs efter reperfusion av det venösa inskjutning transplantatet.
Figur 3. Schematisk bild av kulanefter reperfusion av det venösa inskjutning transplantatet. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anbringa en yttre jugularvenen transplantat i den gemensamma halsartären är en sofistikerad teknik mikrokirurgi. Denna video hjälper nybörjare kirurgen behärska denna teknik på kortast möjliga tid med ett lägre slöseri med försöksdjur.
Inhalativ anestesi är det bästa alternativet för denna operation, eftersom den undviker en alltför djup anestesi skede kan kontrolleras väl och tillåter kirurgen tillräckligt med tid för att fungera. Dessutom råttan är en experimentell djur som erbjuder en lämplig storlek för att utöva sådana komplexa kirurgiska tekniker mycket lättare, i jämförelse med mus.
Fördelen med att använda manschetten-tekniken är att fartyg med olika luminala diameter kan anastomoseras. Det är viktigt att ligera hela omkrets cuffed och utvikt fartyg för att undvika blödning efter reperfusion. Denna modell är mycket lämplig för att simulera hemodynamik med hög blodhastigheten och låg skjuvspänning och studeramekanismer som påverkar utvecklingen av neointimal hyperplasi. Manschetten hindrar fartyget anastomotisk ombyggnad och inducerar turbulens inom transplantatet och därmed utvecklingen av neointimal hyperplasi.
För att förhindra bildning av blodproppar, är det viktigt att placera slips ventransplantat 2 i ett lämpligt läge för att förhindra sammanslutning av blod med slips 1 håller artären på plats (Figur 3). 9 knyta ventransplantat på rekommenderat sätt begränsar trombotiska händelser till 12-13% och ocklusion av kärlet till ännu lägre andel. 15 Eftersom det kan ses i verksamheten videon är det inte lätt att placera slips exakt i den föreslagna läget. Författarna anser att det är avgörande för den distala anastomosen, särskilt på grund av blodflödet riktning. Däremot, anses detta inte absolut viktigt för den proximala anastomosen av samma anledning.
Till skillnad från förfarandet med cava vein som ett transplantat, detta autotransplantation hjälp av den externa halsvenen som implantatet minskar det nödvändiga antalet försöksdjur med hälften. Slutligen anbringa en yttre jugularvenen transplantat i den gemensamma halsartären är en sofistikerad teknik mikrokirurgi. Denna video hjälper nybörjare kirurgen behärska denna teknik på kortast möjliga tid med ett lägre slöseri med försöksdjur. Denna modell är ett utmärkt sätt för nybörjare kirurger att öva manschetten-teknik som idag används i fast organtransplantation i små djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats av forskningen för främjande "START" av den medicinska fakulteten RWTH Aachen University, Tyskland (Titel: "Die Arterialisation venöser Gefäße" START 690.753). Vi vill tacka Mary-Joan Blümich för hennes utmärkta redigering hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Braided Silk black 7-0 | Ethicon Products | 892100 | |
| Vicryl 3-0 | Ethicon Products | J285G | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon Products | J284G | |
| Portex non sterile nylon tubing 0.75 mm, 0.94 mm Fine-Bore Polyethylene (Polythene) Tubing | Portex UK | 800/200/175/100 | |
| Isofluorane 5 % | Any genericon | ||
| Heparin | Any genericon | ||
| 0.9% saline | Any genericon | ||
| Buprenorphine | Any genericon |
References
- Motwani, J. G., Topol, E. J. Aortocoronary saphenous vein graft disease: Pathogenesis, Predisposition, and Prevention. Circulation. 97, 916-931 (1998).
- Bonatti, J., Oberhuber, A., Schachner, T., Zou, Y., Hammerer-Lercher, A., Mittermair, R., Laufer, G. Neointimal hyperplasia in coronary vein grafts: Pathophysiology and prevention of a significant clinical problem. The Heart Surg. , E72-E87 (2004).
- Roy-Chaudhury, P., Kelly, B. S., Zhang, J., Narayana, A., Desai, P., Melhem, M., Duncan, H., Heffelfinger, S. C. Hemodialysis Vascular Access Dysfunction: From Pathophysiology to Novel Therapies. Blood Purif. 21, 99-110 (2003).
- Dixon, B. S. Why don't fistulas mature. Kidney Int. 70, 1413-1422 (2006).
- Newby, A. C., Zaltsman, A. B. Molecular mechanisms in intimal hyperplasia. J. Pathol. 190, 300-309 (2000).
- Schachner, T., Heiss, S., Zipponi, D., Tzankov, A. Perivascular treatment with azathioprine reduces neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Heart Surg. 9, E515-E517 (2006).
- Zhang, L., Sivashanmugam, P., Wu, J. H., Brian, L., Exum, S. T., Freedman, N. J., Peppel, K. Tumor necrosis factor receptor-2 signaling attenuates vein graft neointima formation by promoting endothelial recovery. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 284-289 (2008).
- Tzankov, A., Mairinger, T., Laufer, G., Bonatti, J. O. Local application of rapamycin inhibits neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Ann. Thorac. Surg. 77, 1580-1585 (2004).
- Zou, Y., Dietrich, H., Hu, Y., Metzler, B., Wick, G., Xu, Q. Mouse Model of Venous bypass graft arteriosclerosis. A.J.P. 153, 1301-1310 (1998).
- Schachner, T., Oberhuber, A., Zou, Y., Tzankov, A., Ott, H., Laufer, G., Bonatti, J. Rapamycin treatment is associated with an increased apoptosis rate in experimental vein grafts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 27, 302-306 (2005).
- Ali, Z., Bursill, C., Hu, Y., Choudhury, R. P., Xu, Q., Greaves, D. R., Channon, K. M. Gene transfer of a broad spectrum CC-chemokine inhibitor reduces vein graft atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice. Circulation. 30, 1235-1241 (2005).
- Zou, J., Zhang, X., Yang, H., Zhu, Y., Ma, H., Wang, S. Rapamycin-loaded nanoparticles for inhibition of neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Ann. Vasc. Surg. 25, 538-546 (2011).
- Wang, J., Liu, K., Shen, L., Wu, H., Jing, H. Small interfering RNA to c-myc inhibits vein graft restenosis in a rat vein graft model. J. Surg. Res. 169, e85-e91 (2011).
- Schachner, T., Zou, Y., Oberhuber, A., Mairinger, T., Tzankov, A., Laufer, G., Ott, H., Bonatti, J. Perivascular application of C-type natriuretic peptide attenuates neointimal hyperplasia in experimental vein grafts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 25, 585-590 (2004).
- Thomas, A. C., Newby, A. C. Effect of matrix metalloproteinase-9 knockout on vein graft remodelling in mice. J. Vasc. Res. 47, 299-308 (2010).
