Summary
Interstitial vätska flöde är förhöjd i fasta tumörer och kan modulera tumörcellsinvasion. Här beskriver vi en metod att applicera interstitiell fluidflöde till celler inbäddade i en matris och sedan mäta dess effekt på cellinvasion. Denna teknik kan lätt anpassas för att studera andra system.
Abstract
Tillväxten och utvecklingen av de flesta solida tumörer är beroende på den initiala omvandlingen av cancerceller och deras svar på stroma-associerad signalering i tumören mikromiljö 1. Tidigare har forskning om tumören mikromiljö främst inriktad på tumör-stroma interaktion 1-2. Innehåller dock tumören mikromiljö också en mängd biofysiska krafter, vars effekter fortfarande dåligt kända. Dessa krafter är biomekaniska konsekvenser av tumörtillväxt som leder till förändringar i genuttryck, celldelning, differentiering och invasion 3. Matrix täthet 4, 5-6 styvhet och struktur 6-7, interstitialvätska tryck 8, och interstitiell vätskeflöde 8 är alla förändras under cancer progression.
Interstitial vätska strömmar i synnerhet är högre i tumörer jämfört med normala vävnader 8-10. Den beräknade interstitiell vätska flow hastigheter uppmättes och befanns vara i intervallet 0,1-3 | im s -1, beroende på tumörstorlek och differentiering 9, 11. Detta beror på förhöjd interstitiellt vätsketryck som orsakas av tumör-inducerad angiogenes och ökad vaskulär permeabilitet 12. Interstitial vätska strömma har visat sig öka invasion av cancerceller 13-14, vaskulära fibroblaster och glatta muskelceller 15. Denna invasion kan bero på autologa kemotaktiska gradienter skapas runt cellerna i 3-D-16 eller ökas matrix-metalloproteinas (MMP)-expression 15, kemokin sekretion och celladhesionsmolekyl uttryck 17. Emellertid är den mekanism genom vilken celler avkänna vätskeflödet inte väl förstådda. Förutom att förändra tumören cellbeteende, modulerar interstitiell fluidflöde aktiviteten hos andra celler i tumören mikromiljö. Det är förenat med (a) körning differentiering av fibroblaster i tumör-främjande myofibroblaster 18, (b) transport av antigener och andra lösliga faktorer till lymfkörtlar 19, och (c) modulering av lymfatiska endotelceller morfogenes 20.
Tekniken som presenteras här innebär interstitialvätska flöde på celler in vitro och kvantifierar dess effekter på invasion (figur 1). Denna metod har publicerats i flera studier för att mäta effekterna av vätskeflöde för stromal och cancer cellinvasion 13-15, 17. Genom att ändra matriskompositionen, celltyp och cellkoncentrationen, kan denna metod tillämpas på andra sjukdomar och fysiologiska system för att studera effekterna av interstitiell flöde på cellulära processer såsom invasion, differentiering, proliferation och genexpression.
Protocol
1. Analys Set-up
- Tina en liten alikvot (<500 | il) av Matrigel på is vid 4 ° C (ca 2 h).
- Förbered gel recept (se t.ex. volymer i tabellen nedan): 10x PBS (1x totalt volym), 1 N natriumhydroxid (motsvarande 0,023 volymer till kollagen, eller per kollagen tillverkarens rekommendationer, i förekommande fall), skriver Matrigel och kollagen jag slutkoncentrationer av 1 mg / ml och 1,3 mg / ml (andra matrisformuleringar kan användas beroende på celltyp och experimentet).
Exempelvis gel recept
| Komponenter | Mäldkoncentrationen | Slutkoncentration | Lägg till volymen |
| 10 X PBS | 10X | 1X | 0,090 ml |
| Sterilt vatten | 0,346 ml | ||
| 1 N NaOH | 0,008 ml | ||
| Matrigel | 9,90 mg / ml | 1 mg / ml | 0,101 ml |
| Råttsvans typ I-kollagen | 3,66 mg / ml | 1,3 mg / ml | 0,355 ml |
- Blanda komponenterna i gelén på is i samma sekvens som ovan och inkubera slutliga lösningen under 1 timme vid 4 ° C. Enligt vår erfarenhet en 1 h inkubation före resultat cellsådd i en mer likformig gelning av kollagen. Se till att hålla Matrigel och kollagen på is hela tiden och att arbeta så snabbt som möjligt för att förhindra gelning.
- Ställe 12 mm diameter 8 fim porer cellodlings införs i en 12-brunnsplatta med användning av steriliserade pincetter.
- Räkna celler och återsuspendera i serumfritt medium vid 5 x 10 6 celler / ml (total volym bör vara 10% av gelén lösning).
- Tillsätt 100 pl av cellen suspension till 900 pl gellösningen (slutlig cellkoncentrationen 5 x 10 5 celler / ml) och blanda väl genom att pipettera försiktigt upp och ned.
- Tillsätt 150 pl av den slutliga blandningen till varje insats och överföring till en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 30 minuter tills gelén polymeriserar.
- Användning av serum-fria medier,
- Tillsätt 100 pl på toppen av gelén och 1200 | il under insatsen för statiskt tillstånd. De vätskenivåer inuti insatsen och ute i brunnen bör vara ungefär lika, vilket resulterar i minimal tryckskillnaden över gelén och inget interstitiell flöde.
- Tillsätt 100 ul under insatsen och 650 mikroliter över gel för FLOW tillståndet. Var noga med att undvika luftbubblor under insatsen, då dessa kan hindra celler från att migrera genom membranet på dessa platser. Tryckskillnaden som skapas av dessa volymer är ca 1,3 cm H2O (eller 1 mm Hg).
- Placera plattan i en 37° C, 5% CO2 inkubator i 24 timmar.
2. Cellfärgning och räkna
- Tillsätt 500 pl av 1 X PBS per brunn till nya 24-brunnsplatta, vilket kommer att användas för att tvätta de skär.
- Avlägsna mediet som finns kvar i den övre delen av flödet transwell och bestämma volymen. Beräkna totala eluerade volymen genom att subtrahera den återstående volymen från den totala volymen ursprungligen lagt, 650 fil (denna kommer att användas för beräkningar flödeshastighet, se nedan). Använda bomullstoppar för att avlägsna gelén från skären och att torka den övre ytan av membranet för att avlägsna icke-invaderade celler. Placera skären in i 24-brunnsplattan innehållande 1 x PBS under 15 s för att tvätta skär.
- Avlägsna PBS och tillsätt 500 pl av 4% paraformaldehyd (PFA) under varje insats och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur för att fixera de transmigrated celler.
- Avlägsna PFA och skölj gång med 500 | il 1 X PBS för att avlägsna kvarvarande fixativ.
- Tillsätt 500 pl of 0,5% Triton X-100 lösning under skären och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera cellerna.
- Klipp membran av insatsen med ett rakblad och placera i 100 pl 2 ng / ml DAPI i 1X PBS-lösning, är noga med att placera undersidan av membranet nedåtvända (transmigrated celler nedåt).
- Wrap plattan i aluminiumfolie och placera på en skakapparat vid 150 rpm under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta membranen i 500 | il 1 X PBS på skakanordning (upprepa 3 gånger under 10 minuter vardera) för avlägsnande av fri DAPI.
- Placera membran på glasskivor med transmigrated celler uppåt, lägga montering lösning och täckglas.
3. Dataanalys
- Räkna DAPI-färgade kärnor på 5 slumpmässigt utvalda platser i varje membran (hålla sig borta från kanterna och använda en 10x och 20X objektiv).
- Beräkning av den genomsnittliga cellantalet och erhålla den procentuella invasion genom att använda följande formel:
Procent invasion = 100% x (genomsnittligt celltal X membranytarea) / (yta mikroskopbild x antal celler ympades)
Procenten invasionen kan normaliseras viss kontroll tillstånd (vanligen statiskt tillstånd) för att möjliggöra jämförelse mellan oberoende experiment. - Beräkning av den genomsnittliga flödeshastighet: dela den totala eluerade volymen i flödestillstånd av inkubationstiden (t.ex. 24 timmar).
- Beräkning av den genomsnittliga strömningshastigheten: dela den genomsnittliga flödeshastigheten av tvärsnittsarean av gelén / membran (i detta fall 60 mm 2).
4. Representativa resultat
Att mäta tumörcellsinvasion i interstitiell flöde, utförde vi vår 3-D-analys flöde invasion med användning MDA-MB-435S metastatiska melanomceller. Dessa celler har tidigare visats att invadera som svar på interstitial vätska strömma 13-14. Cellerna inbäddas i en matris bestående av 1,3 mg / ml rått-tail senkollagen typ I och 1 mg / ml Matrigel basalmembranet matris vid en slutlig cellkoncentration av 5 x 10 5 celler per ml. Två olika förutsättningar jämfördes: (1) Genomsnitt interstitiell flöde = 0,1 m s -1 och (2) statiskt tillstånd = ingen mätbar flöde (figur 1).
Efter 24 timmar var de celler som invaderat genom porerna i membranet färgades med DAPI för att underlätta cellräkning. Figur 2 visar en representativ bild av de invaderade cellerna. Under ljusfält, endast porerna i membranet är synliga. Med fluorescens, var de DAPI-färgade kärnor som används för cellräkning och falloidin färgade F-aktin strukturer användes för att visualisera cellkroppen (tillval). Med hjälp av en Students t-test antar lika varians visade vi att interstitiell flödet ökar avsevärt MDA-MB-435S cellinvasion med 2,3-faldig över statiska förhållanden (p = 0,003) (Figur 3). Detta corroboraTes liknande fynd (men med olika matrix betingelser, och därför flödeshastigheter) med användning av denna cell-linje 13-14.
Figur 1. Schematisk ritning av 3-D-interstitiell fluidflöde invasionsanalys. Först förbereder gellösning med hjälp av lämpliga koncentrationer och volymer. Tillsätt sedan celler att gellösningen och överföra till insatser cellodling. Slutligen tillsätt lämplig volym av media för att varje tillstånd och inkubera. Interstitial vätska flöde drivs av en fluid tryckhöjd.
Figur 2. Transmigrated MDA-MB-435S-celler på membranet. Invaderade celler fixerades efter vår interstitiell vätskeflöde invasion analys och färgades med DAPI och Alexa Fluor 488-konjugerad falloidin för att underlätta räkning av invaderade celler; A) Bild på membranet under ljusa området, B) DAPI staINED kärnor (i blått), c) Alexa Fluor 488-falloidin färgade F-aktin (i grönt). Skalstrecket betecknar 50 | am.
Figur 3. Ökad invasion av MDA-MB-435S-celler under flöde. Cellinvasion efter 24 h förbättras signifikant genom interstitiell flöde (p = 0,003). Resultaten är normaliserade till den genomsnittliga statiska tillståndet och värden representerar medelvärde ± SEM av 6 skär cellodlingssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit en metod för att kvantifiera effekten av interstitiell flöde på tumörcellsinvasion, med användning av celler som är inbäddade i en 3-D-matris i en cellodling insatsen. Denna och liknande metoder har använts för att studera effekten av interstitiell flöde på ett antal olika celltyper 13-15, 17. Vårt tillvägagångssätt härmar delvis matrisen mikromiljö av tumören med hjälp av typ I kollagen och Matrigel som innehåller proteiner som finns i källaren membran epitelial vävnad och det omgivande stroma 21-22. Detta system är relativt lätt att installera, okomplicerad, och mer kostnadseffektiv än de flesta mikrofluidikanordningar som används för att studera interstitiell fluidflöde in vitro 23-24. Det kräver inte pumpar eller specialiserade utrustning och tillåter flera villkor som ska testas samtidigt. Vidare är de mätningar som är jämförbara med existerande Boydenkammare-analyser vanligen används för att testa invasion och migraning av cancerceller.
Genom att ändra den celltyp och kompositionen av matrisen, kan olika biologiska system modelleras såsom bröstcancer 13, blodkärl 15 och dendritiska celler handel 17. Förändra matrisen egenskaper och sammansättning och modulera trycket huvudet kommer också ändra interstitiell hastigheten vätskeflödet, vilket möjliggör flexibilitet i analysparametrar beroende det biologiska systemet av intresse. Detta system kan också användas i sam-kultur-analyser. 14, 17
Förutom att mäta invasion beskrivits i interstitialvätskan flödesanalys här kan utvidgas för att mäta förändringar i andra cell-beteenden såsom proteinuttryck, cellproliferation och skillnader i cellsignalering händelser. Cellerna kan lätt isoleras direkt från gelén för RNA, DNA och proteiner extraktion och användes för efterföljande molekylärbiologiska analyser, såsom PCR och westernblot. Detta är en mycket flexibel analys som lätt kan bilda och anpassad för att undersöka effekterna av interstitiell flöde på ett antal cellulära processer i ett antal cell-system.
En av de huvudsakliga nackdelarna med denna analys är det faktum att flödeshastigheter är mycket beroende av matris-koncentration. Flödeshastighet ökar när Matrigel koncentrationen minskar. Detta innebär att en matris bestående enbart av kollagen, som kan användas i studien av stroma associerade celler, kommer att ha högre flödeshastigheter (> 1 ^ m s -1) än en i huvudsak består av Matrigel (<0,05 nm ar -1) för en given tryckskillnad. Om en specifik flödeshastighet krävs, kan en först utföra en inledande test för att identifiera den matris kompositionen som ger den önskade flödeshastigheten. Tjockleken hos gelén kan också varieras för att justera flödeshastigheten. Analysen tillåter inte heller för levande celler avbildning, där beteendet hos individuella celler end förändringar i deras hastighet och riktning kan mätas. Istället tillhandahåller denna analys en ändpunkt mätning av förändringar i invasionen över en population av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F.
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
