Summary
在实体肿瘤间质流体流动升高，可以调节肿瘤细胞的侵袭。在这里，我们描述了技术应用嵌入在一个矩阵的细胞间质流体流动，然后测量其细胞浸润的影响。这种技术可以很容易地适应学习其他系统。
Abstract
大多数实体肿瘤的生长和发展依赖于初始变换的癌细胞，他们的反应基质的相关信号在肿瘤微环境1。此前，在肿瘤微环境的研究主要集中在肿瘤基质的相互作用1-2。然而，肿瘤微环境，还包括各种生物物理力量，其影响仍然知之甚少。这些部队是肿瘤生长的生物力学的后果，导致基因表达的变化，细胞分裂，分化和入侵3。矩阵密度4，5-6，刚度和结构6-7，组织间液压力8，8间质流体流动都改变在癌症的发展。
在肿瘤间质流体流动特别是高于正常组织8-10。估计间质液FLOW速度进行了测量，发现是在0.1-3微米S -1的范围内，根据肿瘤大小和分化9，11。这是由于肿瘤诱导的血管生成和血管通透性增加12所造成的升高间质流体压力。间质流体流动已被证明能增加入侵的癌细胞13-14血管成纤维细胞和平滑肌细胞15。这次入侵可能是由于自体细胞趋化细胞周围建立3 - D 16的梯度或增加15基质金属蛋白酶（MMP）的表达，分泌趋化因子和细胞粘附分子表达17。然而，细胞感受到流体流动的机制，不能很好地理解。此外，改变肿瘤细胞的行为，间质流体流动的调节其他细胞在肿瘤微环境的活动。它与（一）驾驶的成纤维细胞分化成肿瘤促进myofibr州18，（B）抗原的搬运和其他可溶性因子，淋巴结肿大19，（三）调节淋巴管内皮细胞形态20。
这里介绍的技术对体外细胞间质流体流动和量化入侵（ 图1）的影响。这种方法已经公布在基质和癌细胞侵袭13日至15日，17多个研究测量流体流量的影响。通过改变基质组成，细胞类型和细胞浓度，此方法可以适用于其他疾病和生理系统的研究侵袭，分化，增殖，基因表达，如细胞过程间流动的影响。
Protocol
1。含量的设置
- 冰在4°C（约2小时），解冻的基底膜小等分（<500μL）。
- 准备凝胶配方（看到表中的例子卷以下）：10倍PBS（总体积的1倍），1N钠氢（相当于0.023补充胶原蛋白的量，或每的胶原蛋白制造商的建议，如适用），基底膜和胶原键入我来终浓度为1毫克/毫升和1.3毫克/毫升（可用于其他基质配方，根据细胞类型和实验）。
例如凝胶配方
| 组件 | 股权集中度 | 终浓度 | 添加量 |
| 10X PBS | 10X | 1X | 0.090毫升 |
| 无菌水 | 0.346毫升 | ||
| 1N氢氧化钠 | 0.008毫升 | ||
| 基底膜 | 9.90毫克/毫升 | 1毫克/毫升 | 0.101毫升 |
| 鼠尾I型胶原 | 3.66毫克/毫升 | 1.3毫克/毫升 | 0.355毫升 |
- 上述孵育1小时的最终解决方案在同一顺序的混合冰凝胶的组成部分，在4°C根据我们的经验，1小时的孵化前更均匀的胶原凝胶细胞种植结果。确保在任何时候都保持冰基底膜和胶原工作，尽可能快，以防止凝胶。
- 地方12毫米直径8微米孔细胞成12井板，用消毒镊子文化插入。
- 在无血清培养基，在5×10 6细胞/ ml（凝胶溶液总体积应该是10％），计数细胞，重悬。
- 加入100μL细胞苏spension凝胶溶液900μL（最终细胞浓度5×10 5细胞/ ml），调匀移液器轻轻上下。
- 最后的混合物中加入150μL，每个插入和30分钟到37℃，5％ 二氧化碳培养箱，直到凝胶聚合。
- 使用无血清培养基，
- 加入100μL插入静止状态下的凝胶和1200μL上。内插入和良好的外部流体的水平应该大致相等，从而导致整个凝胶，无间隙流的最小压差。
- 插入和650μL上述凝胶的水流条件下，加入100μL。要小心，以避免任何气泡下方的插入，因为他们将阻止细胞通过膜在这些地方迁移。这些卷所产生的压力差约1.3厘米高2 O（或1毫米汞柱）。
- 现浇板在37℃，5％CO2培养箱24小时。
2。细胞染色和计数
- 加入500μL的1X PBS，每到新的24孔板，这将被用来洗插入。
- 取出介质留在的流动transwells的上部和确定音量。从最初的增加，650μL（这将用于流量计算，见下文）总量减去剩余量计算总的洗脱体积。用棉签从插入凝胶和擦拭膜的顶面，以消除非侵入细胞。 24 15秒以及含有1X PBS洗插入板放入插入。
- 除去PBS和添加500μl4％多聚甲醛（PFA）的下孵育30分钟室温，修复transmigrated的细胞和每个插入的。
- 删除的煤灰，用500μl1×PBS冲洗一次，以去除残留的固定液。
- 加入500μLØf 0.5％的Triton X-100的解决方案下的插入和室温孵育10分钟通透细胞。
- 切膜插入到2微克/毫升的DAPI 1X PBS溶液中加入100μl使用刀片和地方，小心地将膜朝下的底面（transmigrated细胞朝下）。
- 保鲜膜板在铝箔上在室温为30分钟150转的振动筛的地方。
- 在500μL1X PBS（重复3次，每次10分钟），以消除自由的DAPI对振动筛洗膜。
- 广场膜transmigrated细胞朝上玻片上，加安装的解决方案和盖玻片。
3。数据分析
- 依靠5随机选择每个膜的位置（远离边缘和使用10X或20X物镜）DAPI染色细胞核。
- 使用下列公式计算平均细胞计数，并取得百分之入侵：
入侵百分比= 100％×（平均细胞计数x膜面积）/（X号的显微图像细胞种子表面面积）
％的入侵可以归到一些控制条件（通常是静态的条件）允许独立的实验之间的比较。 - 计算平均流速：孵化时间（如24小时），总分为洗脱体积流量条件。
- 计算平均流速：凝胶/膜（在这种情况下，60毫米2）截面积除以平均流速。
4。代表结果
以质流量下测量肿瘤细胞的侵袭，我们执行我们的3-D流使用的MDA-MB-435S转移性黑色素瘤细胞侵袭实验。先前已被证明这些细胞侵入间质流体流动13-14。细胞包埋在1.3毫克/毫升大鼠大组成的矩阵升肌腱I型胶原和1毫克/毫升基底膜基底膜矩阵，最终细胞浓度在5×10 5细胞/毫升。两个不同的条件进行了比较：（1）= 0.1微米s-1和（2）静止状态=没有可测量的流量平均间隙流（ 图1）。
24小时后，用DAPI染色的膜，毛孔侵入细胞，通过促 进细胞计数。 图2显示了一个入侵细胞的形象代表。根据明，只有膜孔是可见的。使用荧光，细胞核DAPI染色细胞计数和鬼笔环肽染色F-肌动蛋白的结构，用于可视化的细胞体（可选）。使用学生的t检验假设方差相等时，我们发现，间质性流量显着增加的MDA-MB-435S细胞浸润，由静态条件下的2.3倍（P = 0.003）（ 图3）。这corrobora工商业污水附加费类似的结果（但不同基质条件，因此流速），使用这种细胞线13-14。
图1。的3-D间质流体流动的入侵检测的原理图。首先准备凝胶溶液使用适当的浓度和体积。再加入细胞凝胶溶液，并转移到细胞培养插入。最后加入适当体积的媒体每个条件和孵化。间质流体流动是由流体压头。
图2。Transmigrated膜的MDA-MB-435S细胞。入侵细胞被固定后，间质流体流动的入侵检测和染色DAPI和的Alexa Fluor 488标记的鬼笔，以方便侵入细胞的计数;图片的亮场下膜），B）的DAPI STA独立非执行董事的细胞核（蓝色），C）的Alexa Fluor 488-鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白（绿色）。比例尺代表50微米。
图3。增加流量下的MDA-MB-435S细胞的入侵。 24小时后的细胞入侵质流（P = 0.003）显着提高。结果正常化平均静态条件下的值代表平均值±SEM 6细胞培养插入。
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Discussion
在这里，我们所描述的量化对肿瘤细胞浸润间流动的影响，使用一个3-D矩阵嵌入细胞内的细胞培养插入方法。这和其他类似的方法已被用来研究多种细胞类型，13日至15日，17间流动的影响。我们的做法，部分模仿使用类型的肿瘤基质微环境，我胶原和基底膜含有蛋白质发现在基底膜上皮组织和周围基质21-22。这个系统是相对容易的设置了，简单，更具成本比大多数微流体装置，用来研究在体外 23-24间质流体流动的有效。它不需要泵或专用设备，并允许同时测试多个条件。此外，测量可比现有的Boyden小室检测的常用测试入侵和运移TION的癌细胞。
通过改变细胞类型和组成的矩阵，可以是不同的生物系统建模，如乳腺癌13，血管15，和树突状细胞贩卖17。改变矩阵的性质，组成和调节压头，也将改变间质流体流动的速度，从而检测参数依赖于利益的生物系统的灵活性。该系统还可以用于共培养实验，14，17
在除了测量侵袭，间质流体流动分析这里可以扩大在其他细胞的行为变化，如蛋白质表达，细胞增殖和细胞信号事件的差异来衡量。细胞可以很容易地直接分离的RNA，DNA凝胶，蛋白提取，用于后续的分子生物学检测，如PCR和Western污点。这是一个高度灵活的分析，可以很容易地设置和调整调查范围的细胞过程中的电池系统间流动的影响。
此法的主要缺点之一是基质浓度，流速非常依赖的事实。流速增加随着基底膜浓度的降低。这意味着一个矩阵仅由胶原蛋白组成，可用于相关间质细胞的研究，将有超过一个组成的基底膜（S -1 <0.05微米），主要用于高流速（> 1微米S -1）一个给定的压力差。如果一个特定的流速是必需的，可以先进行初步测试，以确定基质组成，提供所需的流速。凝胶的厚度也可变化来调整流速。该法还不允许对活细胞成像，其中单个细胞的行为在他们的速度和方向的D转换可以衡量的。相反，该法提供了一个改变整个人口的细胞入侵的端点测量。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | EMD Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma-Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma-Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | Cellgro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | Cellgro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4',6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-052-CI | Keep sterile |
References
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