Summary
La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d'échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs.
Abstract
La dopamine est un neurotransmetteur vigoureusement étudiée dans le SNC. En effet, son implication dans l'activité locomotrice et la récompense liée au comportement a favorisé cinq décennies d'enquête sur les carences moléculaires associés à la réglementation la dopamine. La majorité de ces demandes de régulation de la dopamine dans le cerveau sur mise au point de la base moléculaire de sa réglementation dans les régions de champ terminales des voies nigrostriataux et mesoaccumbens; striatum et le noyau accumbens. En outre, ces études se sont concentrées sur l'analyse du contenu des tissus de la dopamine avec la normalisation du poids des tissus seulement humide. Enquête sur les protéines qui régulent la dopamine, comme la tyrosine hydroxylase (TH) des protéines, la phosphorylation TH, transporteur de la dopamine (DAT), et vésiculaires transporteur de monoamines 2 (VMAT2) protéine souvent ne comprennent pas l'analyse du contenu des tissus de la dopamine dans le même échantillon. La capacité à analyser à la fois le contenu des tissus de la dopamine et de ses protéines régulatrices (y compris post-tramodifications nslational) ne donne pas seulement le pouvoir inhérent à l'interprétation de la relation de la dopamine au niveau des protéines et la fonction de TH, DAT ou VMAT2, mais s'étend également l'économie de l'échantillon. Cela se traduit par un coût moindre, tout en produisant un aperçu de la régulation moléculaire de la dopamine dans pratiquement n'importe quel paradigme de choix des enquêteurs.
Nous nous concentrons les analyses dans le mésencéphale. Bien que le SN et VTA sont généralement négligé dans la plupart des études de régulation de la dopamine, ces noyaux sont facilement disséqué avec la pratique. Une lecture complète du contenu du tissu de la dopamine et TH, DAT ou VMAT2 peut être effectuée. Il est en plein essor la littérature sur l'impact de la fonction de dopamine dans le SN et VTA sur le comportement, et les empiétements de substances exogènes ou des procédés qui y sont la maladie 1-5. En outre, des composés tels que les facteurs de croissance ont un effet profond sur les protéines de la dopamine et la dopamine-régulation, dans une mesure relativement plus grande dans le SN ou VTA Nous allons illustrer la technique de dissection de séparer ces deux noyaux et le traitement d'échantillons de tissus disséqués qui produit un profil révélant les mécanismes moléculaires de régulation de la dopamine in vivo, spécifiques pour chaque noyaux (figure 1).
Protocol
1. Dissection
- Sur un lit de glace humide, se détendre une matrice cerveau des rongeurs (coupes coronales séparés de 1 mm d'écart), une boîte de Pétri contenant 5 rasoirs, et d'un scalpel n ° 11. Dans un récipient séparé, étiqueté lieu tubes de 2 ml de taille microfuges dans la glace sèche.
- L'enquêteur de choisir la méthode d'euthanasie. Nous avons des résultats reproductibles qui effectuent une anesthésie très bref avec de l'isoflurane, l'idéal, un vaporisateur doit être utilisé. Toutefois, s'il n'est pas disponible, nous utilisons un pot contenant une batterie de grande plate-forme. Avec le pot de la batterie située dans une hotte de ventilation approuvée, placer une compresse de gaze isoflurane-saturée en dessous de la plate-forme et attendre 3-5 minutes pour permettre à l'isoflurane pour saturer le pot de la batterie. Placez le rat à l'intérieur et de supprimer la décapitation dès que le rat a perdu conscience. Éliminer rapidement le cerveau (idéalement en moins de deux minutes), rincer sous l'eau froide, et placer immédiatement dans la matrice cerveau de rongeur réfrigérés.
- Une minute après la positionIng le cerveau dans la matrice, insérer les lames de rasoir froid dans le cerveau refroidi, en commençant à environ 2 mm rostrales au chiasma optique, si le striatum et le noyau accumbens sont souhaitées pour l'analyse en plus les noyaux du mésencéphale. Continuer à insérer les lames de rasoir froid avec chaque section de 1 mm jusqu'à arriver au milieu de la protubérance, étaler le placement de chaque lame de rasoir subséquente de manière à faciliter l'enlèvement facile de chaque lame individuelle.
- Lorsque vous tirez sur les rasoirs, regardez le début de l'hippocampe. Quand il a complètement enroulé autour du mésencéphale, commencent à prendre sections en utilisant la lame de scalpel n ° 11, comme illustré dans la figure 2.
- Immédiatement placer le tissu disséquée dans le tube de centrifugeuse préalablement refroidie sur la glace sèche. Chez le rat, il faut s'attendre à être en mesure de disséquer SN et VTA d'un minimum de deux coupes coronales et un maximum de trois. Magasin tissus à -80 ° C jusqu'au moment du traitement.
2. L'analyse des tissus: HPLC fou de la dopamine et des métabolites
Pour des informations complètes sur le matériel HPLC et l'entretien, reportez-vous à l'analyse HPLC, à la fin du manuscrit.
- Doucement homogénéiser le tissu immédiatement après l'enlèvement de la glace sèche-glacé utilisant 0,1 M HClO 4-EDTA (0,1 M HClO 4 et 0,1 mM d'EDTA) 9, qui contient du N-méthyl dopamine à une concentration de 20 ng / ml, qui sert un étalon interne pour la récupération de l'échantillon lors de l'analyse par HPLC. L'homogénéisateur nous utilisons est un Sonifier Branson 150, avec le réglage à 10% de la pleine puissance (1 de 10). Les volumes de sonication suivantes sont recommandées:
Chez le rat, SN = 250 pi (dissection unilatérale), 400 pi (dissection bilatérale), VTA = 200 (dissection unilatérale) ul, 400 ul (dissection bilatérale).
Chez la souris, (dissections bilatérales seulement), SN = 200 pi, VTA = 200 pi. - Après homogénéisation, maintenez échantillons sur de la glace sèche. Les échantillons sont ensuite CENTRIFUGEuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) à 12.000 RPM pour les sédiments du culot protéique doit être utilisé pour les déterminations de western blot. Les surnageants sont injectés directement dans l'HPLC. Les volumes d'injection suivants sont recommandés pour une analyse précise chez le rat ou la souris: (. Soit de prep) SN = 150 (. Soit de préparation), VTA = 160 pi
- La norme de réserve est préparée à 1 mg / ml en ajoutant la quantité appropriée de monoamines et des métabolites de la composante * la dopamine à 0,1 M d'acide perchlorique 0,1 mM d'EDTA. La concentration de chaque composé est de 1 mg / ml, sauf tryptophane qui est de 5 mg / ml. La norme de stock est divisé en 10 aliquotes et stockés dans le ultra jusqu'à ce que nécessaire.
* Tous les poids sont corrigés de la forme d'un sel du composé le cas échéant.
Préparer l'étalon de travail en diluant une aliquote de 10 pl de la norme de stock à 100 ml de la solution d'acide perchlorique. Concentration de l'étalon de travail est de 0,1 pg / ml, sauf le tryptophane qui est de 0,5 pg / ml. 50 pi decette norme de travail est injecté dans l'HPLC pour un montant à la colonne de 5 ng de chaque composant, sauf tryptophane qui est de 25 ng. - Détermination de la reprise au sein de la dopamine aliquote de l'échantillon:
Il ya plusieurs étapes pour déterminer la récupération dopamine à partir d'une aliquote de l'échantillon. - D'abord, il faut diviser la hauteur du pic de dopamine de l'échantillon par la hauteur du pic de la dopamine de la norme et de se multiplier ce ratio par le montant total (ng) de la dopamine dans la norme. Notre concentration de dopamine norme est de 0,1 pi ng / uL et 50 de la norme est dosé. Ainsi, la quantité de dopamine dans la norme est de 5 ng. Ainsi, l'équation ci-dessous peut être utilisé pour la récupération dopamine déterminée dans un échantillon donné:
(Hauteur du pic de dopamine dans l'échantillon / dopamine hauteur de pic dans la norme) * 5 ng - Correction de la perte de l'échantillon à l'aide de l'étalon interne de N-méthyl dopamine:
La reprise effective de la N-méthyl dopamine est calculé de la même manière que la dopamine en divisant le dop N-méthylamine hauteur du pic de l'échantillon par la hauteur du N-méthyl dopamine pic de l'étalon et en multipliant ce ratio par le montant total (ng) de N-méthyl dopamine dans la norme. Comme la dopamine, notre concentration standard la dopamine N-méthyl est de 0,1 ng / mL. 50 pl de la norme est dosé. Ainsi, le montant de la N-méthyl dopamine dans la norme est de 5 ng. Ainsi, l'équation ci-dessous peut être utilisée pour déterminer la récupération dopamine N-méthyl dans un échantillon donné:
(N-méthyl hauteur de pic de la dopamine dans l'échantillon / N-méthyl hauteur de pic de dopamine dans la norme) * 5 ng
Cependant, en raison de la dopamine N-méthyl dans chaque échantillon provient pas de l'échantillon lui-même, mais à partir du tampon de CLHP, la quantité de N-méthyl dopamine prévu dans chaque échantillon est calculée. La concentration de dopamine N-méthyl en HPLC tampon est de 20 ng / ml ou 0,02 ng / uL, de sorte que le montant prévu de N-méthyl-dopamine dans chaque échantillon est obtenue en multipliant la concentration de dopamine N-méthyl de la mémoire tampon HPLC par le volume de l'aliquote de chaque échantillon utilisé pour HL'analyse de l'automate. Ceci est démontré dans l'équation ci-dessous:
(0,02 ng / uL) * (volume de l'aliquote de l'échantillon utilisé pour l'analyse HPLC) - La différence entre le prévu et récupéré la N-méthyl dopamine peut alors être utilisée pour corriger la pour la quantité de dopamine récupéré en ajustant pour toute perte d'échantillon. Simplement prendre le rapport de la N-méthyl prévue dopamine / récupéré N-méthyl dopamine et multiplier par le montant de la dopamine récupéré. Ainsi, l'équation globale de la quantité de dopamine dans une aliquote de l'échantillon est donnée ci-dessous:
(Hauteur de pic dopamine dans la hauteur du pic d'échantillonnage / dopamine dans la norme) * (N-méthyl hauteur de pic de dopamine dans la norme / N-méthyl hauteur de pic de la dopamine dans l'échantillon) * (0,02 ng / pi) * (volume de l'aliquote de l'échantillon utilisé pour l'analyse HPLC ) - Dopamine total récupéré à partir d'un échantillon:
La valeur de la dopamine récupéré à partir d'un aliquote d'échantillon est ensuite utilisé pour extrapoler la quantité totale de la dopamine dans un échantillon donné. Cela se fait en divisant le montant recouvré (ng) of DA par le volume de l'aliquote et en multipliant cette valeur par le volume total de tampon CLHP que l'échantillon a été traité par ultrasons po Ceci est donné par l'équation ci-dessous:
(Montant (ng) de la dopamine dans l'échantillon aliquote / volume de aliquote de l'échantillon) * (volume total de tampon HPLC dans laquelle l'échantillon a été traité par ultrasons).
Le lecteur est renvoyé aux études suivantes 2,4,10 pour une présentation complète de l'évaluation de la dopamine et de ses métabolites en conjonction avec lectures de la dopamine-régulation des protéines non seulement dans SN et VTA, mais accumbens striatum et le noyau ainsi.
3. L'analyse des tissus: Total normalisation des protéines et final des résultats TH et DAT
- Placez les boulettes de protéines précipitées (provenant du traitement de tampon HPLC) dans de la glace humide pour maintenir à 4 ° C. Veiller à ce que tous les tampon a été retiré et archivé (si l'analyse de confirmation est nécessaire). Si le SN ou VTA doit être traitée bilatéralement (rat seulement), ajouter 300 ul (SN) ou 200 uL (VTA) de 1% de SDS contenant 5 mM de Tris (pH 8,3) et 1 mM d'EDTA au culot et soniquer. Ajouter 150 ul de la solution de SDS à SN pellets ou granulés de 100 pi à IDV si le traitement des tissus à partir de dissections unilatérales.
- Placer les échantillons dans l'eau bouillante pour près ~ 5 minutes à remplir dénaturation des protéines et laisser refroidir à température ambiante. Veiller à ce que les capuchons sont solidement maintenus à cette étape.
- Déterminer la concentration de protéines dans les échantillons en utilisant le dosage BCA, y compris une courbe standard de protéines (albumine norme) gamme de 2 à 40 pg de protéine. Volume de dosage ul 5 de l'échantillon en trois exemplaires et d'utiliser la valeur médiane pour déterminer la quantité de protéines contre la courbe standard. Diviser par le volume de dosage pour la concentration de protéines. Notez que ce n'est le premier des deux mesures prises pour normaliser TH total, DAT, et VMAT2 résultats à la récupération des protéines totales.
- Préparer les échantillons avec un tampon d'échantillon (contenant dithiothréitol) pour réduire SDS-électrophorèse sur 10% d'acrylamide gels. Idéalement, la concentration en protéine totale finale devrait être ~ 2 pg / pl. La raison de cette sélection de concentration est de réduire le volume de l'échantillon nécessaire à la détermination finale de la phosphorylation de TH, comme ~ 100 pg de protéine totale sera nécessaire pour le chargement de quantifier précisément ser31 et ser40 phosphorylation TH. Si la couleur jaune est vu dans l'échantillon après l'ajout d'un tampon d'échantillon, l'échantillon est trop acide. Ajouter 1 M Tris (pH 8,2) par incréments de 10 pi jusqu'à la couleur bleue est rétablie.
- Préparer les échantillons comme suit pour les déterminations suivantes de la dopamine-régulation des protéines:
- TH: Dans un étalon calibré pour la protéine TH (en ng), la concentration de TH (comme TH par ng par g de protéine totale) dans le SN devrait se situer à partir de 0,05 à 0,27 ~ TH ng par g de protéine totale 2,4, 7,10,11. Contre une courbe linéaire standard TH, allant de 0,5 à 5,0 ng TH et en utilisant un anticorps primaire à TH (cat # Millipore AB152, dilution 1:1000 en PVP T-20 Blocage solution) qui produit une courbe linéaire standard, la charge optimale de la protéine totale de la SN doit être ~ 10 pg. La concentration de TH dans l'aire tegmentale ventrale varie de ~ 0,4 à 1,0 ng par TH 4,11 pg de protéine. Ainsi, la charge totale en protéines pour VTA devrait être ~ 5 pg.
- DAT: Les quantités relatives de DAT dans SN ou VTA sont significativement inférieure à celle dans les régions apparentées sur le terrain du terminal de striatum et le noyau accumbens 4. L'expression relative de DAT comme normalisée à la protéine TH récupéré est également significativement plus faible chez SN et VTA. En conséquence, les charges de protéines pour la quantification des protéines dans les DAT SN ou VTA besoin d'être beaucoup plus grande par rapport aux charges d'échantillonnage des régions sur le terrain du terminal. Un minimum de 30 pg de protéine totale est nécessaire pour la précision de DAT évaluation VTA et une charge nominale de 50 pg de protéine totale est nécessaire pour l'évaluation dans le SN. L'anticorps primaire utilisé est de Santa Cruz, cat # sc-1433.
- VMAT2: L'expression de VMAT2, De manière normalisée à la protéine totale, est plus grande dans les régions que mesoaccumbens nigrostriataux. Cependant, par rapport à l'expression TH, l'expression est plus grande dans VMAT2 SN et le moins dans le striatum 4. Utilisation de Santa Cruz cat # sc-15314, une charge protéique total nominal de ~ 40 pg pour être le meilleur pour la quantification des VMAT2.
- Exécutez la quantité appropriée de protéines totales par SDS-PAGE sur des gels d'acrylamide 10%. L'unité de Bio-Rad protéiforme électrophorèse II est utilisé pour les déterminations, ce qui est un format de gel important. Transférer les protéines sur nitrocellulose 0,45 um taille des pores. Pour le transfert, un réservoir Hoeffer fixée à au moins 27 volts permet le transfert doit avoir lieu pendant la nuit.
- Autoriser les taches sécher pendant au moins 30 minutes, puis la tache avec une solution Ponceau S (1% Ponceau S à 5% d'acide acétique glacial) pour environ 5 minutes. De-tache vigoureusement avec une solution de HCl 0,2% jusqu'à ce que des bandes de protéines individuelles bien résoudre et une coloration de fond est éliminé. Obtenir une image de la S Ponceau tacheING en utilisant Image J afin de mieux quantifier les charges relatives protéines dans chaque couloir et à normaliser TH, DAT ou VMAT2 résultats (figure 3).
4. L'analyse des tissus: un site spécifique phosphorylation TH
La phosphorylation de la TH au ser31 ou ser40 peut augmenter la L-DOPA dans les cellules catécholaminergiques biosynthèse 12. Bien que le montant de la phosphorylation sur chaque site nécessaire d'augmenter la L-DOPA biosynthèse dans les régions cérébrales dopaminergiques comme SN et VTA n'est pas établie, il est évident que ser31 phosphorylation joue un rôle important dans la régulation de la biosynthèse de la L-DOPA 10 et co-varie avec DA teneur en tissu entre le striatum, le noyau accumbens, SN, et VTA 2, 10. Néanmoins, l'inclusion de ser40 déterminations sont nécessaires, comme de nombreuses études montrent que cela peut affecter l'activité TH, en particulier si un seuil est atteint de la phosphorylation de 12.
Alors que ser19 phosphorylatisur n'affecte pas l'activité TH seuls 13,14, il peut être considéré comme une sentinelle pour le Ca 2 +-dépendante de signalisation dans le neurone DA, étant donné que Ca 2 + extracellulaire est nécessaire d'augmenter la phosphorylation ser19 sous conditions dépolarisant 12. En outre, il existe une corrélation positive significative de la phosphorylation ser19 avec ser31 phosphorylation seulement dans le SN et VTA 10, ce qui signifie que ser19 état de phosphorylation pourrait affecter ser31 phosphorylation, et donc indirectement la L-DOPA biosynthèse.
Considérations de charge exemples pour la quantification optimale du site-spécifique stoechiométrie phosphorylation TH: Ci-dessous, les éléments requis pour une détermination exacte et précise de la phosphorylation de TH spécifique au site dans les tissus disséqués est présenté. Lorsque cela est possible, une norme TH calibré phosphorylation devrait être inclus dans l'évaluation de la phosphorylation de TH de l'échantillon. La charge de l'échantillon doit tenir selonontant stoechiométrie inhérente à chaque site de phosphorylation de telle sorte que le dosage quantifie la phosphorylation dans la plage dynamique de travail de l'anticorps étant utilisés. Comme note finale, la protéine totale inhérente à venir dans le test pour chaque échantillon doit être également chargé dans les ruelles de la courbe standard. Ceci est facilement réalisé avec une protéine porteuse (tel que le foie de rat) qui n'exprime pas TH.
- . ser19 Parmi les trois sites de phosphorylation, ser19 niveaux de phosphorylation stœchiométrie sont plus importants dans SN et VTA, allant de 0,15 à 0,25 2,10,11. L'autre considération est que, par notre méthode de détection, ser19 ps est quantifié dans la gamme linéaire entre 0,5 et 5,0 ng phospho-ser19 10. Compte tenu de ces considérations, une charge totale de protéines TH entre 5 et 10 ng (donnant ainsi une estimation 0,75 - 2,5 phospho-ser19 ng de l'échantillon) constituerait une mesure fiable de la phosphorylation ser19 TH. Nous utilisons Phosphosolutions primaire (Cat. # P1580-19) à dilution 1:1000.
- ser31. ser31 niveaux de phosphorylation stœchiométrie sont relativement moins dans les SN et VTA par rapport à leurs congénères des régions sur le terrain de terminaux, allant de ~ 0,04 à 0.10 2,4,10,11. Par notre méthode de détection, ser31 ps est détectée dans la gamme linéaire entre 0,5 et 7,0 ng phospho-ser31 10. Compte tenu de ces considérations, une charge totale de protéines TH entre 10 et 30 ng (donnant ainsi une estimation 0,50 - 3,0 ng phospho-ser31 de l'échantillon) aurait fournir une mesure fiable de la phosphorylation ser31TH. Voir la figure 4A pour un exemple de ser31 quantification. Notre anticorps primaire est un en interne purifiée par affinité des anticorps qui ont été fabriqués par 21 biochimiques du XXI e siècle, (Boston, MA), et validé pour la spécificité de la phospho-épitope utilisant nos propres normes 2.
- ser40 ser40 niveaux de phosphorylation de la stœchiométrie de SN et la gamme VTA de ~ 0,02 -. 0,06 2,4,10,11. Par notre méthode de détection, sER40 ps est détectée dans la plage linéaire entre 0,2 et 2,0 ng phospho-ser40 10. Compte tenu de ces considérations, une charge totale de protéines TH entre 10 et 30 ng (donnant ainsi une estimation 0,20 - 1,8 ng phospho-ser40 de l'échantillon) aurait fournir une mesure fiable de la phosphorylation ser40TH. Voir la figure 4B pour un exemple de ser40 quantification. Nous utilisons Phosphosolutions primaire (Cat. # P1580-40) à dilution 1:1000.
5. Les résultats représentatifs
- Dopamine dans SN vs ATV Il ya trois lectures de la dopamine (ou de ses métabolites) qui peuvent être prises dans l'analyse quantitative;. Selon totale récupérée de la dissection, par protéine, et par la protéine TH (comme en témoignent le striatum, le SN, le noyau accumbens, et VTA dans le tableau 1 ci-dessous). La récupération totale de la dopamine entre SN et VTA est assez comparable, comprise entre 6-9 ng pendant deux à trois dissections coronaires tranche 2. La normalisation de récupération dopamine à la protéine totale montrera that, basée sur la méthode de dissection occupée, que l'ADV aura une plus grande dopamine par des protéines totales, en moyenne 6-8 ng / mg de protéine dans SN et 9-10 ng / mg de protéine dans ADV 2, 4. Enfin, la normalisation de la dopamine à TH totale récupérée devrait également révéler une différence entre SN et VTA, étant plus grande dans l'aire tegmentale ventrale 10, et comprise entre 0,2 et 0,8 ng dopamine par la protéine TH ng entre les deux régions 2,10.
DA région Total des DA récupéré DA par mg de protéine DA par TH ng striatum 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Nucleus accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Les protéines totales: TH, DAT, VMAT2 utilisant la norme TH calibré pour la quantification des protéines, plus TH est récupérée dans SN que le VTA de la dissection (60 ng dans SN et 26 ng dans VTA 2). Toutefois, lorsqu'elle est normalisée à la protéine, cette relation s'inverse, avec TH par des protéines totales dans l'aire tegmentale ventrale étant ~ 3 - à 5 fois plus élevée que dans le SN, (~ 0,32 ng / mg de protéines dans VTA et ~ 0,09 en SN) 4, 10.
La reprise attendue de la DAT en SN et VTA est similaire, avec une récupération un peu plus dans l'aire tegmentale ventrale selon protéines totales ou en tant que TH totale récupérée par 4. Notamment, la protéine DAT est beaucoup moins abondante dans ces régions par rapport aux régions apparentées sur le terrain du terminal 4 VMAT2 de récupération comme par protéine totale est plus grande dans l'aire tegmentale ventrale par rapport SN 4. Toutefois, lorsqu'elle est normalisée à la protéine TH, il ya récupération légèrement plus grande dans le SN 4. - Site spécifique phosphorylation TH D'un certain nombre d'études, il ya eu des résultats cohérents en ser19, ser31, ser40 et la quantité de phosphorylation dans le SN et VTA, et aussi en relation avec les régions apparentées sur le terrain du terminal. Ser19 phosphorylation est notablement plus grande dans le SN et VTA (~ 0.2 à 0,3) par rapport à striatum et le noyau accumbens (~ 0.05 à 0.15) 2,4,7,10,11. Ser31 phosphorylation est significativement moindre dans le SN et VTA par rapport à leurs congénères des régions sur le terrain de terminaux, étant ~ 0,06 à 0,10 entre ces régions somatodendritiques 2,4,7,10,11. Au cours de l'inhibition de la décarboxylase de l'acide aromatique avec NSD-1015, il ya une augmentation de 2 fois dans ser31 phosphorylation dans la VTA seulement 10. Ser40 gammes de phosphorylation entre 0,02 et 0,05 dans le SN etVTA et généralement cette stoechiométrie ne diffère pas significativement des régions apparentées sur le terrain du terminal 2,4,7,10,11.
Figure 1. Lectures dopaminergiques de l'une dissection des tissus.
Technique de dissection Figure 2. Pour isoler le neuropile mésencéphale dopaminergique. Technique pour disséquer la substantia nigra (SN) de l'aire tegmentale ventrale du (VTA). 1. Retirer du cortex sus-jacente et de l'hippocampe (ces structures ont déjà été supprimés dans l'image ci-dessus). 2. Faites une coupe verticale qui sépare la zone pigmentée de la SN de l'aire tegmentale ventrale. 3. Effectuer une coupe horizontale à ou près de la ligne médiane juste au-dessus de la partie la plus dorsale et latérale de la SN. 4. Taquiner le SN l'écart du reste du tronc cérébral. Une fois que SN a été supprimé, de même taquiner le VTA loin de lareste du mésencéphale. Remarque: cette section est généralement observée au point de coordonnées, par rapport à Bregma, à AP 5.7.
Figure 3. Deuxième (et dernier) la normalisation de la protéine coloration totale de charge Ponceau S pour l'analyse Image J. La coloration des protéines Ponceau S d'une détermination TH total dans les échantillons de rats substantia nigra. Les cinq premières voies forment la gauche sont la courbe TH standard totale, à laquelle pg de protéine 28 de homogénat de foie de rat a été ajouté à refléter la charge protéique à partir des échantillons substantia nigra. La voie suivante contient le poids moléculaire (MW) marqueurs. Les voies restantes contiennent ~ protéines 28μg à partir d'échantillons de rats substantia nigra. Les charges protéiques sont basées sur la concentration en protéine de chaque échantillon déterminé par la méthode BCA. Toutefois, en dépit de ce que devrait être une charge égale, il existe des variations dans l'obscurité de la coloration Ponceau S entre les échantillons indiquant un légervariabilité des concentrations des protéines, qui est corrigée par une normalisation en utilisant une analyse ImageJ à analyser la quantité de coloration Ponceau S pour chaque échantillon.
Figure 4. Les résultats représentatifs TH phosphorylation de contrôles et les traitements. Représentant ser31 hydroxylase tyrosine phosphorylée (PTH) et ser40 blots PTH occidentaux de salines et de la méthamphétamine chez des rats Wistar traités à partir d'une étude précédente 4. A. ser 31 PTH dans des échantillons de rats substantia nigra. Les calibrés ser 31 gammes de PTH courbe standard de 0,3 ng à 2,0 ng, elle est dans la plage linéaire de détection. Basé sur une analyse par transfert Western précédente des niveaux de TH au total, 6 ng de TH total ont été chargés pour chaque échantillon. B. ser40 PTH chez le rat ventral échantillons tegmentale. Les ser40 calibrés gammes PTH courbe standard de 0,2 ng à 1,5 ng, elle est dans la plage linéaire de détection. Basé sur une analyse par transfert Western précédente des niveaux de TH au total, 9 ng de TH total ont été chargés pour chaque échantillon.
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Discussion
Comme il est indiqué dans la figure 1, les méthodes décrites ci-dessus devrait produire plusieurs lectures de la dopamine et son TH régulation des protéines, DAT, et VMAT2 d'un échantillon de SN ou VTA obtenu à partir de chez le rat ou la souris. Encore une fois, les avantages de la réalisation de ce protocole sont que l'enquêteur peut obtenir un indicateur de vue opérationnel appariés de la façon dont la dopamine est régulée in vivo dans pratiquement n'importe quel paradigme expérimental et, ce faisant, sauver d'importantes ressources expérimentales en réduisant le nombre d'animaux requis dans une expérience.
Il est absolument impératif que l'enquêteur respecter les exigences de température imposées lors de la dissection (4 ° C), le stockage de tissus (au moins à -70 ° C), la sonication de tissus (sonication immédiate après le retrait de la température de stockage) dans de la glace froide HPLC tampon et la formation subséquente à granulés et de traitement. Une fois le culot est soniquée et bouilli dans une solution de SDS, les échantillons peuvent continuer à être Further traitées à la température ambiante. Stockage des archives HPLC analysé l'échantillon et les échantillons tampons échantillon préparé pour l'analyse des protéines doit être à -80 ° C.
Encore une fois, l'avantage majeur de ce protocole est l'approche innée à-match sur le plan opérationnel les résultats se rapportant à la régulation de la dopamine in vivo. En outre, la normalisation des lectures de tissus à des marqueurs de la dopamine neuropile dopaminergiques (TH, DAT) fournissent une large mesure de l'assurance que l'enquêteur est dissection SN ou VTA avec cohérence et précision. Compte tenu de l'implication de la dopamine dans la dépendance, troubles psychiatriques, et les arènes de locomotion, ce protocole pourrait être utilisé dans de nombreuses expériences. Une limitation notable est que l'interprétation des résultats de phosphorylation TH doit être prudente, car elle n'est pas connue à ce jour dans la mesure où une augmentation de la phosphorylation au ser31 ou ser40 est nécessaire in vivo pour augmenter la L-DOPA biosynthèse. Cependant, comme mentionné, il est evidence que ser31 phosphorylation semble réguler la biosynthèse de L-DOPA et joue un rôle dans la régulation de la teneur totale en tissus de la dopamine dans les 2,10 CNS. A cette époque, les normes pour la protéine TH et la phosphorylation TH ne sont pas disponibles dans le commerce. Toutefois, ce laboratoire a maintenu et élargi ces normes basées sur celles utilisées lors de la première étude sur la réglementation phosphorylation TH in vivo a été publié le 11. Pourtant, il est possible de normaliser le contenu des tissus dopamine à la protéine TH récupéré dans ces régions discrètes en utilisant ce protocole.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Financement pour le travail cela, et comme cité 2,10, a été fourni, en partie, par un octroi de subventions de recherche à MF Salvatore de la Fédération américaine de recherche sur le vieillissement, Edward P. Le Fonds d'affectation spéciale et Stiles Biomedical Research Foundation du Nord-Ouest en Louisiane, et à la norme BS Pruett de la Bourse Muslow Ike prédoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
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The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
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The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
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The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
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Pump: Shimadzu LC-10AD |
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| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
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| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
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Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
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References
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