Perfiles Integral del Reglamento de la dopamina en la sustancia negra y el área tegmental ventral

Summary

La dopamina está claramente regulado en los núcleos del cerebro medio, que contiene la celda de los cuerpos y las dendritas de las neuronas de dopamina. Aquí se describe un método de disección y manejo de la muestra-para maximizar los resultados, y por lo tanto las conclusiones y puntos de vista, sobre la regulación de la dopamina en el núcleo del cerebro medio de la sustancia negra (SN) y el área tegmental ventral (VTA) en los roedores.

Abstract

La dopamina es un neurotransmisor con fuerza estudió en el SNC. De hecho, su participación en la actividad locomotora y la conducta relacionada con la recompensa ha promovido cinco décadas de investigación sobre las deficiencias moleculares asociados con la regulación de la dopamina. La mayoría de estas investigaciones de la regulación de la dopamina en el centro del cerebro sobre la base molecular para su regulación en las regiones terminales de campo de las vías y nigroestriatales mesoaccumbens, cuerpo estriado y núcleo accumbens. Además, estos estudios se han concentrado en el análisis del contenido de tejido dopamina con la normalización de peso sólo tejido húmedo. La investigación de las proteínas que regulan la dopamina, como la tirosina hidroxilasa (TH) de proteínas, la fosforilación de TH, transportador de dopamina (DAT), y el transportador vesicular de monoaminas 2 (VMAT2) de proteínas a menudo no incluyen el análisis de contenido de tejido de la dopamina en la misma muestra. La capacidad de analizar tanto el contenido de tejido dopamina y sus proteínas reguladoras (incluyendo el post-TRAmodificaciones nslational) no sólo le da el poder inherente a la interpretación de la relación de la dopamina con el nivel de proteínas y la función de TH, DAT, o VMAT2, sino que también se extiende a la economía de la muestra. Esto se traduce en un menor costo, y sin embargo, produce ideas sobre la regulación molecular de la dopamina en prácticamente cualquier paradigma de la elección de los investigadores.

Nos centramos el análisis en el cerebro medio. Aunque el SN y VTA son típicamente descuidado en la mayoría de los estudios de regulación de dopamina, estos núcleos son fácilmente disecados con la práctica. Una lectura completa del contenido de los tejidos la dopamina y la TH, DAT, o VMAT2 puede llevarse a cabo. Existe un creciente literatura sobre el impacto de la función de la dopamina en el VTA SN y en el comportamiento y las Tropezaciones de sustancias exógenas o procesos de enfermedades en ellos ^1-5. Además, los compuestos tales como factores de crecimiento tiene un profundo efecto sobre las proteínas de dopamina y la dopamina-regulación, en un grado relativamente mayor en el SN o VTA <sup> 6-8. Por lo tanto, esta metodología se presenta para referencia a los laboratorios que deseen ampliar sus investigaciones sobre cómo los tratamientos específicos modulan el comportamiento y la regulación de la dopamina. Aquí, un método de varios pasos que se presentan para el análisis de contenido de tejido de dopamina, los niveles de proteína de TH, DAT, o VMAT2 y TH fosforilación de la sustancia negra del mesencéfalo y VTA de los roedores. El análisis de la fosforilación de TH puede proporcionar importantes conocimientos sobre no sólo cómo la actividad de TH se regula, sino también las cascadas de señalización en los núcleos afectados somatodendrítica en un paradigma determinado.

Vamos a ilustrar la técnica de disección para separar estos dos núcleos y el procesamiento de la muestra de tejido disecado que produce un perfil de revelar los mecanismos moleculares de regulación de dopamina in vivo, específicos para cada núcleos (Figura 1).

Protocol

1. Disección Sobre un lecho de hielo húmedo, enfriar una matriz de cerebro de roedores (cortes coronales separados 1 mm de diferencia), una placa de Petri que contiene 5 hojas de afeitar, y un bisturí # 11. En un recipiente separado, lugar marcado 2 ml tubos de microfuga de tamaño en hielo seco. El investigador elegirá el método de la eutanasia. Tenemos resultados reproducibles realización de una anestesia con isoflurano muy breve, idealmente, un vaporizador debe ser utilizado. Sin embargo, s…

Discussion

Como se indica en la Figura 1, los métodos detallados anteriormente deben producir lecturas múltiples de dopamina y su TH proteínas reguladoras, DAT, y VMAT2 de una muestra de SN o VTA obtenerse a partir de la rata o el ratón. Una vez más, los beneficios de la realización de este protocolo es que el investigador puede obtener lecturas operativamente con ajuste de cómo se regula la dopamina in vivo bajo virtualmente cualquier paradigma experimental y, al hacerlo, ahorrar considerables recursos experimenta…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.