Summary
La dopamina está claramente regulado en los núcleos del cerebro medio, que contiene la celda de los cuerpos y las dendritas de las neuronas de dopamina. Aquí se describe un método de disección y manejo de la muestra-para maximizar los resultados, y por lo tanto las conclusiones y puntos de vista, sobre la regulación de la dopamina en el núcleo del cerebro medio de la sustancia negra (SN) y el área tegmental ventral (VTA) en los roedores.
Abstract
La dopamina es un neurotransmisor con fuerza estudió en el SNC. De hecho, su participación en la actividad locomotora y la conducta relacionada con la recompensa ha promovido cinco décadas de investigación sobre las deficiencias moleculares asociados con la regulación de la dopamina. La mayoría de estas investigaciones de la regulación de la dopamina en el centro del cerebro sobre la base molecular para su regulación en las regiones terminales de campo de las vías y nigroestriatales mesoaccumbens, cuerpo estriado y núcleo accumbens. Además, estos estudios se han concentrado en el análisis del contenido de tejido dopamina con la normalización de peso sólo tejido húmedo. La investigación de las proteínas que regulan la dopamina, como la tirosina hidroxilasa (TH) de proteínas, la fosforilación de TH, transportador de dopamina (DAT), y el transportador vesicular de monoaminas 2 (VMAT2) de proteínas a menudo no incluyen el análisis de contenido de tejido de la dopamina en la misma muestra. La capacidad de analizar tanto el contenido de tejido dopamina y sus proteínas reguladoras (incluyendo el post-TRAmodificaciones nslational) no sólo le da el poder inherente a la interpretación de la relación de la dopamina con el nivel de proteínas y la función de TH, DAT, o VMAT2, sino que también se extiende a la economía de la muestra. Esto se traduce en un menor costo, y sin embargo, produce ideas sobre la regulación molecular de la dopamina en prácticamente cualquier paradigma de la elección de los investigadores.
Nos centramos el análisis en el cerebro medio. Aunque el SN y VTA son típicamente descuidado en la mayoría de los estudios de regulación de dopamina, estos núcleos son fácilmente disecados con la práctica. Una lectura completa del contenido de los tejidos la dopamina y la TH, DAT, o VMAT2 puede llevarse a cabo. Existe un creciente literatura sobre el impacto de la función de la dopamina en el VTA SN y en el comportamiento y las Tropezaciones de sustancias exógenas o procesos de enfermedades en ellos 1-5. Además, los compuestos tales como factores de crecimiento tiene un profundo efecto sobre las proteínas de dopamina y la dopamina-regulación, en un grado relativamente mayor en el SN o VTA Vamos a ilustrar la técnica de disección para separar estos dos núcleos y el procesamiento de la muestra de tejido disecado que produce un perfil de revelar los mecanismos moleculares de regulación de dopamina in vivo, específicos para cada núcleos (Figura 1).
Protocol
1. Disección
- Sobre un lecho de hielo húmedo, enfriar una matriz de cerebro de roedores (cortes coronales separados 1 mm de diferencia), una placa de Petri que contiene 5 hojas de afeitar, y un bisturí # 11. En un recipiente separado, lugar marcado 2 ml tubos de microfuga de tamaño en hielo seco.
- El investigador elegirá el método de la eutanasia. Tenemos resultados reproducibles realización de una anestesia con isoflurano muy breve, idealmente, un vaporizador debe ser utilizado. Sin embargo, si no está disponible, se utiliza un frasco que contiene una batería de gran tamaño de la plataforma. Con el frasco de la batería situada en una campana de ventilación aprobado, coloque una gasa isoflurano-saturada por debajo de la plataforma y esperar 3-5 minutos para permitir que el isoflurano para saturar el frasco de la batería. Colocar la rata en el interior y eliminar por decapitación tan pronto como la rata ha perdido la conciencia. Eliminar rápidamente el cerebro (idealmente en menos de dos minutos), enjuague con agua fría, y colocar de inmediato en la matriz del cerebro de roedores fría.
- Un minuto después de la posiciónING en el cerebro en la matriz, insertar las cuchillas de afeitar en frío en el cerebro refrigerado, comenzando alrededor de 2 mm rostral al quiasma óptico si el cuerpo estriado y el núcleo accumbens se desean para el análisis, además de los núcleos mesencéfalo. Continuar la inserción de cuchillas de afeitar en frío con cada sección de 1 mm hasta llegar a mitad de camino a través de la protuberancia, el escalonamiento de la colocación de cada hoja de afeitar posterior con el fin de facilitar la fácil retirada de cada hoja individual.
- Al tirar de las maquinillas de afeitar, mira para el inicio del hipocampo. Cuando se ha completamente envuelto alrededor del mesencéfalo, comienzan a tomar secciones usando la cuchilla # 11 escalpelo, como se ilustra en la Figura 2.
- Inmediatamente colocar el tejido disecado en el tubo de microcentrífuga, previamente enfriado en el hielo seco. En la rata, esperan ser capaces de diseccionar SN y VTA desde un mínimo de dos rebanadas coronales y un máximo de tres. Tienda de tejidos a -80 ° C hasta que estén listos para su procesamiento.
2. Análisis de tejidos: HPLC fo la dopamina y metabolitos
Para información completa sobre el equipo de HPLC y mantenimiento, se refieren a análisis por HPLC al final del manuscrito.
- Suavemente homogeneizar tejido inmediatamente después de la eliminación de hielo seco usando enfriado con hielo 0,1 M HClO 4-EDTA (0,1 M HClO 4 y 0,1 mM de EDTA) 9, que contiene N-metil dopamina a una concentración de 20 ng / ml que sirve como un patrón interno para la recuperación de la muestra durante el análisis por HPLC. El homogeneizador que utilizamos es un Sonifier Branson 150, con el ajuste en el 10% de la potencia total (1 de 10). Los volúmenes de sonicación se recomienda lo siguiente:
En las ratas, SN = l 250 (la disección unilateral), 400 l (disección bilateral), VTA = 200 (la disección unilateral) l, 400 l (disección bilateral).
En el ratón, (disecciones bilaterales solamente), SN = 200 l, VTA = 200 l. - Después de la homogeneización, mantener las muestras en hielo seco. Las muestras son luego Centrifuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) a 12.000 rpm para sedimentar el precipitado de proteína que se emplea para la determinación de Western blot. Los sobrenadantes se inyectan directamente en la HPLC. Los volúmenes de inyección se recomienda lo siguiente para un análisis preciso, en la rata o el ratón: (. Ya sea de preparación) SN = 150 (. Ya sea de preparación), VTA = 160 l
- La solución madre se prepara a 1 mg / ml mediante la adición de la cantidad apropiada de monoaminas y metabolitos * de componente dopamina a 0,1 M de ácido perclórico 0,1 mM de EDTA. La concentración de cada compuesto es de 1 mg / ml de triptófano, excepto que es de 5 mg / ml. La solución madre se divide en 10 ml de alícuotas y almacenado en la ultrabajo hasta que se necesite.
* Todos los pesos están corregidos para la forma de sal del compuesto en su caso.
Preparar el estándar de trabajo mediante la dilución de una parte alícuota de 10 l de solución madre a 100 ml de la solución de ácido perclórico. La concentración del patrón de trabajo es de 0,1 g / ml, excepto triptófano que es de 0,5 g / ml. 50 l deeste patrón de trabajo se inyecta en el HPLC para una cantidad en columna de 5 ng de cada componente, excepto triptófano, que es de 25 ng. - Determinación de la recuperación de dopamina dentro alícuota de muestra:
Hay varios pasos para determinar la recuperación de la dopamina a partir de una alícuota de la muestra. - En primer lugar, dividir la altura del pico de dopamina de la muestra por la altura del pico de dopamina de la norma y multiplicar este cociente por la cantidad total (ng) de dopamina en la norma. Nuestra concentración de dopamina estándar es 0,1 l ng / l, y 50 de la norma se ensaya. Así, la cantidad de dopamina en el estándar es de 5 ng. Por lo tanto, la siguiente ecuación puede ser utilizado para la recuperación de la dopamina determinada en una muestra dada:
(Altura del pico de dopamina en la altura de la muestra / dopamina máximo en la norma) * 5 ng - La corrección de la pérdida de la muestra utilizando el estándar interno N-metil-dopamina:
La recuperación efectiva de N-metil dopamina se calcula de la misma manera que la dopamina dividiendo el dop N-metilamina pico de altura en la muestra por la altura dopamina N-metil pico del patrón y multiplicando este cociente por la cantidad total (ng) de N-metil dopamina en la norma. Al igual que la dopamina, nuestro estándar de N-metil concentración de dopamina es de 0,1 ng / mL. 50 l de la norma se ensaya. Así, la cantidad de N-metil dopamina en el estándar es de 5 ng. Por lo tanto, la siguiente ecuación se puede utilizar para determinar N-metil recuperación de dopamina en una muestra dada:
(N-metil altura del pico de dopamina en la muestra / N-metil altura del pico de dopamina en estándar) * 5 ng
Sin embargo, debido a que la dopamina N-metil en cada muestra no proviene de la misma muestra, pero desde el buffer de HPLC, la cantidad de N-metil dopamina espera en cada muestra se calcula. La concentración de dopamina N-metil en HPLC tampón es de 20 ng / ml o 0,02 ng / l, por lo que la cantidad esperada de N-metil-dopamina en cada muestra se determina multiplicando la concentración de dopamina N-metil del tampón de HPLC por el volumen de la alícuota de cada muestra utilizada para HPLC análisis. Esto se demuestra en la siguiente ecuación:
(0,02 ng / l) * (volumen de la alícuota de muestra utilizada para el análisis por HPLC) - La diferencia entre la espera y se recuperó N-metil dopamina puede entonces ser utilizada para corregir el por la cantidad de dopamina se recuperó mediante el ajuste de cualquier pérdida de muestra. Simplemente tome la proporción de N-metil esperado dopamina / recuperó N-metil dopamina y multiplicarlo por la cantidad de dopamina recuperado. Así, la ecuación general de la cantidad de dopamina en una parte alícuota de la muestra se da a continuación:
(Altura del pico de dopamina en la altura del pico de la muestra / dopamina en estándar) * (N-metil altura del pico de dopamina en estándar / N-metil altura del pico de dopamina en la muestra) * (0,02 ng / l) * (volumen de la alícuota de muestra utilizada para el análisis por HPLC ) - Dopamina total recuperado de una muestra:
El valor de la dopamina se recuperó de una parte alícuota de la muestra se utiliza luego para extrapolar la cantidad total de dopamina en una muestra dada. Esto se hace dividiendo la cantidad recuperada (ng) Of DA por el volumen de la alícuota y multiplicando este valor por el volumen total de tampón de HPLC que la muestra se sometió a sonicación pulg Esto viene dado por la ecuación siguiente:
(Cantidad (ng) de la dopamina en alícuota / volumen de la alícuota de muestra) * (volumen total de tampón de HPLC en el que la muestra se sometió a sonicación).
Se remite al lector a los siguientes estudios 2,4,10 para una presentación completa de la evaluación de la dopamina y sus metabolitos en relación con las lecturas de la dopamina-la regulación de las proteínas, no sólo en SN y ATV, pero estriado y el núcleo accumbens, también.
3. Análisis del tejido: la normalización total de proteínas y final de los resultados de TH y DAT
- Coloque los gránulos de proteínas precipitadas (derivado del tratamiento tampón HPLC) en hielo húmedo para mantener 4 ° C. Asegúrese de que el tampón se ha eliminado y se archivan (si se requiere análisis de confirmación). Si la SN o VTA se va a procesar bilateral (rata solamente), añadir 300 l (SN) o 200 l (VTA) de 1% de SDS que contenía 5 mM Tris (pH 8,3) y EDTA 1 mM a la pastilla y sonicado. Añadir 150 ml de la solución de SDS a SN gránulos o pellets de l 100 a VTA, si el procesamiento de tejidos a partir de disecciones unilaterales.
- Colocar las muestras en agua hirviendo cerca de ~ 5 minutos para completar la desnaturalización de proteínas y dejar enfriar a temperatura ambiente. Asegurarse de que las tapas están bien sujetos en esta etapa.
- Determinar la concentración de proteína en las muestras utilizando el ensayo BCA, incluyendo una curva estándar de la proteína (albúmina estándar) intervalo de 2 a 40 mg de proteína. Ensayo de 5 l de volumen de la muestra por triplicado y usar el valor de la mediana para determinar la cantidad de proteína contra la curva estándar. Dividir por el volumen de ensayo para la concentración de proteína. Nótese que esta es la primera de las dos medidas adoptadas para normalizar TH total, DAT, y los resultados VMAT2 a la recuperación total de proteínas.
- Preparar las muestras con tampón de muestra (que contenía ditiotreitol) para reducir la SDS-electroforesis en acrilamida 10 g%ELS. Idealmente, la concentración final de proteína total debe ser ~ 2 g / l. La razón de esta selección concentración es reducir el volumen de muestra necesaria para la determinación final de la fosforilación de TH, como ~ 100 g de proteína total será necesario para la carga de cuantificar con precisión ser31 y ser40 fosforilación TH. Si el color amarillo se ve en la muestra después de la adición de tampón de muestra, la muestra es demasiado ácida. Añadir 1 M Tris (pH 8,2) en incrementos de 10 l hasta que el color azul se restablece.
- Preparar las muestras de la siguiente manera para las siguientes determinaciones de dopamina que regulan las proteínas:
- TE: contra un estándar calibrado para la proteína TH (como ng), la concentración de TH (como TH por ng por mg de proteína total) en la SN se espera que van desde ~ 0.05-0.27 TH ng por mg de proteína total de 2,4, 7,10,11. Frente a una curva lineal estándar de TH, que van desde 0,5 hasta 5,0 ng TH y el uso de anticuerpo primario a TH (gato Millipore # AB152, dilución 1:1000 en PVP T-20 Solución de bloqueo) que produce una curva estándar lineal, la carga óptima de la proteína total de la SN debe ser ~ 10 g. La concentración de TH en el AVT se va de ~ 0,4 a 1,0 ng por TH proteínas g 4,11. Por lo tanto, la carga total de proteínas para VTA debe ser ~ 5 g.
- DAT: Las cantidades relativas de DAT en SN o VTA son significativamente menor que en las regiones de campo afines terminales de cuerpo estriado y núcleo accumbens 4. La expresión relativa de DAT normalizado a la proteína TH recuperado es también significativamente menor en SN y el ATV. En consecuencia, las cargas de proteína para la cuantificación de la proteína DAT en SN o VTA tienen que ser mucho mayor en comparación con las cargas de muestra de las regiones de campo del terminal. Un mínimo de 30 g de proteína total que se necesita para la precisión en la evaluación de DAT en el VTA y una carga nominal de la proteína de 50 mg total es de necesidad para la evaluación de la SN. El anticuerpo primario utilizado es el de Santa Cruz, cat # sc-1433.
- VMAT2: La expresión de VMAT2, Como normalizado a la proteína total, es mayor en las regiones que mesoaccumbens nigroestriatales. Sin embargo, con respecto a la expresión de TH, la expresión VMAT2 es mayor en SN como mínimo y en el cuerpo estriado 4. Uso de Santa Cruz de gato # sc-15314, una carga nominal total de proteína de ~ 40 mg a ser mejor para la cuantificación de VMAT2.
- Ejecutar la cantidad apropiada de proteína total utilizando SDS-PAGE en geles de acrilamida al 10%. El Bio-Rad Protean unidad de electroforesis II se utiliza para las determinaciones, que es un formato de gel grande. Transferir las proteínas en 0,45 micras de tamaño de poro de nitrocelulosa. Para la transferencia, un tanque de Hoeffer establecerse en por lo menos 27 voltios que permite la transferencia tenga lugar durante la noche.
- Permitir la blots secar durante al menos 30 minutos y luego se tiñen con solución Ponceau S (1% Ponceau S en glacial ácido acético al 5%) durante ~ 5 minutos. De mancha de fuerza con un 0,2% solución de HCl hasta que las bandas de proteínas individuales resuelven con claridad y la tinción de fondo se elimina. Obtener una imagen de la mancha S Ponceaución con J en la imagen para cuantificar aún más las cargas relativas de proteína en cada carril y normalizar la TH, DAT, o VMAT2 resultados (Figura 3).
4. Análisis de tejidos: sitio específico de fosforilación de TH
La fosforilación de la TH en la ser31 ser40 o puede aumentar la biosíntesis de L-DOPA en células catecolaminérgicas 12. Aunque la cantidad de fosforilación en cada sitio necesario aumentar la biosíntesis de L-DOPA en regiones del cerebro dopaminérgicas como SN y VTA no está establecida, existe evidencia de que ser31 fosforilación juega un papel importante en la regulación de la biosíntesis de L-DOPA 10 y co-varía con DA tejidos contenido entre el cuerpo estriado, el núcleo accumbens, SN, y VTA 2, 10. Sin embargo, la inclusión de ser40 determinaciones son necesarias, ya que numerosos estudios muestran que puede afectar a la actividad de TH, en particular si un umbral de fosforilación se llega a 12.
Mientras ser19 phosphorylatien no afecta a la actividad TH solo 13,14, se puede considerar un centinela de Ca 2 +-dependiente de señalización en la neurona DA, dado que Ca 2 + extracelular es necesario aumentar ser19 fosforilación bajo condiciones despolarizante 12. Por otra parte, existe una correlación positiva y significativa de la fosforilación con ser19 ser31 fosforilación sólo en la SN y VTA 10, lo que significa que ser19 estado de fosforilación podría afectar a ser31 fosforilación, y así, indirectamente, la biosíntesis de L-DOPA.
Consideraciones sobre la muestra de carga para la cuantificación óptima de sitio específico estequiometría fosforilación TE: A continuación, las consideraciones requeridas para determinaciones exactas y precisas de fosforilación TH sitio-específica en los tejidos disecados se presenta. Cuando sea posible, un estándar de TH fosforilación calibrado deben ser incluidos en la evaluación de la fosforilación de la muestra TH. La carga de la muestra debe tener en accestequiometría onto inherente en cada sitio de fosforilación de modo que el ensayo de fosforilación cuantifica dentro de la gama dinámica de trabajo del anticuerpo que se utiliza. Como nota final, la proteína intrínseca total de entrada en el ensayo para cada muestra debe ser también cargado en los carriles de la curva estándar. Esto se consigue fácilmente con una proteína portadora (tales como el hígado de rata), que no expresa TH.
- . ser19 De los tres sitios de fosforilación, ser19 niveles estequiometría de fosforilación son mayores en SN y ATV, que van desde 0,15 hasta 0,25 2,10,11. La otra consideración es que por nuestro método de detección, ser19 ps se cuantifica en el rango lineal entre 0,5 y 5,0 ng fosfo-ser19 10. Teniendo en cuenta estas consideraciones, una carga TH proteína total entre 5 y 10 ng (dando así un estimado de 0,75 a 2,5 ng ser19 fosfato de la muestra) sería una medida fiable de la fosforilación de TH ser19. Usamos Phosphosolutions primaria (Cat. # P1580-19) en la dilución 1:1000.
- ser31 ser31. los niveles de fosforilación estequiometría son comparativamente menos en SN y el ATV en comparación con sus regiones afines terminal de campo, que van desde ~ 0,04 hasta 0,10 2,4,10,11. Por nuestro método de detección, ser31 ps se detecta en el rango lineal entre 0,5 y 7,0 ng 10 fosfo-ser31. Teniendo en cuenta estas consideraciones, una carga TH proteína total entre 10 y 30 ng (dando así un estimado de 0,50 a 3,0 ng fosfo-ser31 de la muestra) sería una medida fiable de la fosforilación ser31TH. Ver la Figura 4A muestra un ejemplo de ser31 cuantificación. El anticuerpo primario es un in-house purificado por afinidad anticuerpo que ha sido fabricado por 21 bioquímicos del siglo XXI, (Boston, MA), y validada por la especificidad de la fosfo-epítopo con nuestros estándares internos de la 2.
- ser40 ser40 niveles estequiometría de fosforilación en la SN y la gama de ATV ~ 0,02 -. 0.06 2,4,10,11. Por nuestro método de detección, sER40 ps se detecta en el rango lineal entre 0,2 y 2,0 ng fosfo-ser40 10. Teniendo en cuenta estas consideraciones, una carga TH proteína total entre 10 y 30 ng (dando así un estimado de 0,20 a 1,8 ng fosfo-ser40 de la muestra) sería una medida fiable de la fosforilación ser40TH. Véase la figura 4B para un ejemplo de ser40 cuantificación. Usamos Phosphosolutions primaria (Cat. # P1580-40) en la dilución 1:1000.
5. Los resultados representativos
- La dopamina en SN vs ATV Hay tres lecturas de la dopamina (o sus metabolitos) que se pueden tomar en el análisis cuantitativo;. Según total recuperado de la disección, por proteínas, y por la proteína TH (demostrado por el cuerpo estriado, SN, el núcleo accumbens, y VTA en la Tabla 1 a continuación). La recuperación de la dopamina total entre SN y el ATV es bastante similar, oscilando entre 6.9 ng por dos o tres disecciones corte coronal 2. La normalización de la recuperación de la dopamina a la proteína total se muestran That, basado en el método de disección empleado, que el VTA tendrá mayor dopamina por la proteína total, un promedio de 6-8 ng / mg de proteína en SN y 9-10 ng / mg de proteína en VTA 2, 4. Por último, la normalización de la dopamina para TH total recuperado también revelan una diferencia entre SN y el ATV, siendo mayor en el VTA 10, y que oscila entre 0,2 y 0,8 ng dopamina proteína TH por ng entre las dos regiones 2,10.
DA región DA total se recuperó DA por mg de proteína DA por ng TH estriado 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Núcleo de corriente alternacumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Proteínas totales: TH, DAT, VMAT2 Utilizando el estándar de proteínas TH calibrada para la cuantificación, más de TH se recupera en la SN que el VTA de la disección (60 ng en SN y 26 ng de VTA 2). Sin embargo, cuando se normalizó a las proteínas, esta relación se invierte, con TH por la proteína total en el VTA es ~ 3 - a 5 veces mayor que en el SN, (aproximadamente 0,32 ng / mg de proteína en VTA y 0,09 ~ en SN) 4, 10.
La esperada recuperación de DAT en SN y el ATV es similar, con la recuperación de un poco más en el VTA de acuerdo con la proteína total o según TH total recuperado 4. Notablemente, la proteína DAT es mucho menos abundante en estas regiones en comparación con las regiones de campo afines terminales 4 VMAT2 de recuperación de acuerdo con la proteína total es mayor en el VTA contra SN 4. Sin embargo, cuando se normalizaron a la proteína de TH, hay recuperación ligeramente mayor en el SN 4. - Sitio específico de fosforilación de TH de una serie de estudios, se han producido resultados consistentes en ser19, ser31, ser40 y la cantidad de fosforilación en la SN y el ATV, y también en relación a las regiones de campo afines terminales. Ser19 fosforilación es notablemente mayor en el SN y VTA (~ 0.2 hasta 0,3) en comparación con el cuerpo estriado y núcleo accumbens (~ 0.05 a 0.15) 2,4,7,10,11. Ser31 fosforilación es significativamente menor en el SN y ATV en comparación con sus regiones afines terminales de campo, siendo ~ 0,06 a 0,10 entre estas regiones somatodendríticos 2,4,7,10,11. Durante la inhibición de la descarboxilasa del ácido aromático con NSD-1015, hay un aumento de 2 veces en ser31 fosforilación en el único 10 de VTA. Ser40 fosforilación rangos entre 0,02 y 0,05 en el SN yVTA y, en general esta estequiometría no difiere significativamente de las regiones de campo afines terminales 2,4,7,10,11.
Figura 1. Lecturas dopaminérgicas de una disección de los tejidos.
Figura 2. Disección técnica para aislar el neuropilo del cerebro medio dopaminérgico. Técnica de disección de la sustancia negra (SN) de área tegmental ventral (VTA). 1. Quitar la corteza suprayacente y el hipocampo (estas estructuras ya han sido eliminados en la imagen superior). 2. Haga un corte vertical que separa el área pigmentada de la SN de la VTA. 3. Hacer un corte horizontal en o cerca de la línea media justo por encima de la parte más dorsal y lateral de la SN. 4. Tease la SN lejos del resto del tronco cerebral. Una vez que SN se ha eliminado, de manera similar se burlan de la VTA lejos de laresto del cerebro medio. Nota: esta sección se observa típicamente en las coordenadas, con relación a bregma, en el AP 5.7.
Figura 3. Segundo (y último) la normalización de las proteínas totales de carga Ponceau S tinción para el análisis de la imagen J. Tinción Ponceau S de proteínas de una determinación de TH total en ratas substantia nigra muestras. Los primeros cinco carriles de la izquierda se forma de la curva estándar de TH total, a la que la proteína mg 28 de homogeneizado de hígado de rata se añadió para reflejar la carga de proteínas de las muestras de la sustancia negra. El carril de al lado tiene peso molecular (MW) marcadores. Los carriles restantes contienen proteínas ~ 28μg de rata substantia nigra muestras. Las cargas de proteínas se basan en la concentración de proteína de cada muestra como se determina por el método BCA. Sin embargo, a pesar de lo que debería ser cargas iguales, hay variaciones en la oscuridad de la tinción de Ponceau S entre las muestras que indican un ligerovariabilidad en las concentraciones de proteína, que se corrige por la normalización utilizando el análisis de ImageJ para analizar la cantidad de tinción Ponceau S para cada muestra.
Figura 4. Representante resultados de fosforilación de TH de los controles y tratamientos. Representante ser31 hidroxilasa tirosina fosforilada (PTH) y ser40 manchas de PTH occidentales de las ratas tratadas con solución salina y la metanfetamina Wistar de un estudio previo 4. A. 31 servicios de PTH en ratas substantia nigra muestras. Los calibrados servi 31 rangos de PTH curva estándar de 0,3 ng a 2,0 ng y está dentro del rango lineal de detección. Basado en el análisis anterior Western blot de los niveles totales de TH, 6 ng de TH total fueron cargados para cada muestra. B. ser40 PTH en ratas tegmental ventral muestras. Los rangos calibrados ser40 PTH curva estándar de 0,2 ng a 1,5 ng y está dentro del rango lineal de la detección. Basado en el análisis anterior Western blot de los niveles totales de TH, 9 ng de TH total fueron cargados para cada muestra.
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Discussion
Como se indica en la Figura 1, los métodos detallados anteriormente deben producir lecturas múltiples de dopamina y su TH proteínas reguladoras, DAT, y VMAT2 de una muestra de SN o VTA obtenerse a partir de la rata o el ratón. Una vez más, los beneficios de la realización de este protocolo es que el investigador puede obtener lecturas operativamente con ajuste de cómo se regula la dopamina in vivo bajo virtualmente cualquier paradigma experimental y, al hacerlo, ahorrar considerables recursos experimentales mediante la reducción del número de animales requerido en cualquier experimento.
Es absolutamente necesario que el investigador observar los requisitos de temperatura impuestas durante la disección (4 ° C), el almacenamiento de tejido (por lo menos -70 ° C), sonicación tejido (sonicación inmediata después de la eliminación de la temperatura de almacenamiento) en tampón enfriado con hielo y HPLC subsiguiente formación de sedimento y el procesamiento. Una vez que el sedimento se sonicó y se hierve en solución de SDS, las muestras pueden seguir siendo Further procesados a temperatura ambiente. El almacenamiento de archivado HPLC análisis de la muestra y las muestras de tampón de la muestra preparada para el análisis de proteínas debe ser de -80 ° C.
Una vez más, la ventaja principal del protocolo es el enfoque innata de los resultados operacionales de concordancia relacionados con la regulación de la dopamina en vivo. Por otra parte, la normalización de las lecturas de dopamina del tejido a los marcadores de neuropilo dopaminérgica (TH, DAT), proporcionan un alto grado de certeza de que el investigador es la disección de SN o ATV, con coherencia y precisión. Dada la implicación de la dopamina en la enfermedad de la adicción, psiquiátrico, y las arenas del aparato locomotor, este protocolo podría ser utilizado en muchos experimentos. Una limitación notable es que la interpretación de los resultados de fosforilación TH debe ser conservador, ya que no se conoce en este momento el grado en que se requiere un aumento de la fosforilación en ser31 ser40 o in vivo para aumentar la biosíntesis de L-DOPA. Sin embargo, como se ha mencionado, hay evdencia de que ser31 fosforilación parece regular la biosíntesis de L-DOPA y tiene un papel en la regulación del contenido total de tejido de la dopamina en el SNC 2,10. En este momento, las normas para la proteína TH y fosforilación TH no están disponibles comercialmente. Sin embargo, este laboratorio ha mantenido y ampliado sobre la base de dichas normas que se utilizan cuando el primer documento sobre la regulación TH fosforilación in vivo fue publicado el 11. Sin embargo, es posible para normalizar el contenido de tejido dopamina a la proteína TH recuperado en estas regiones discretas utilizando este protocolo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El financiamiento para el trabajo de este, y 2,10, como se cita, fue proporcionada, en parte, por unos premios de investigación de subvención a Salvatore MF de la Federación Americana para la Investigación del Envejecimiento, el Edward P. Stiles Fondo Fiduciario y la Fundación para la Investigación Biomédica del Noroeste de Louisiana, y BS Pruett de la beca predoctoral Muslow Ike, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
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HPLC system: |
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The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
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The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
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The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
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Pump: Shimadzu LC-10AD |
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| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
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| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
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Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
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References
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