Summary
A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.
Abstract
A dopamina é um neurotransmissor vigorosamente estudada no SNC. Na verdade, o seu envolvimento na atividade locomotora e recompensa comportamentos relacionados promoveu cinco décadas de investigação sobre as deficiências moleculares associados com a regulação da dopamina. A maioria destas investigações de regulação de dopamina no cérebro o foco sobre a base molecular para a sua regulação em regiões terminais de campo das vias nigrostiatais e mesoaccumbens; estriado e nucleus accumbens. Além disso, esses estudos têm-se concentrado na análise do teor de tecido da dopamina, com normalização ao peso do tecido apenas molhado. Investigação das proteínas que regulam a dopamina, tais como tirosina hidroxilase (TH), proteína de fosforilação TH, do transportador de dopamina (DAT) e transportador monoamina vesicular 2 (VMAT2) proteína muitas vezes não incluem a análise do teor de dopamina no tecido da mesma amostra. A capacidade de analisar tanto o conteúdo do tecido da dopamina e suas proteínas de regulação (incluindo pós-tramodificações nslational) não só dá o poder inerente ao interpretar a relação da dopamina com o nível da proteína ea função de TH, DAT, ou VMAT2, mas também se estende economia amostra. Isso se traduz em menor custo, e ainda produz insights sobre a regulação molecular da dopamina em praticamente qualquer paradigma de escolha dos investigadores.
Nós nos concentramos nas análises no mesencéfalo. Embora o SN e VTA são normalmente negligenciados na maioria dos estudos de regulação da dopamina, esses núcleos são facilmente dissecados com a prática. Uma leitura abrangente do conteúdo tecido dopamina e TH, DAT, ou VMAT2 pode ser realizado. Não é florescente literatura sobre o impacto da função dopaminérgica no SN e VTA sobre o comportamento, e as imposições de substâncias exógenas ou processos doença nisso 1-5. Além disso, os compostos, tais como factores de crescimento têm um efeito profundo sobre as proteínas da dopamina e da dopamina-regulador, a uma extensão comparativamente maior no SN ou VTA Iremos ilustrar a técnica de dissecação para segregar estes núcleos duas eo processamento da amostra de tecido dissecado que produz um perfil revelando mecanismos moleculares de regulação da dopamina in vivo, específicas para cada núcleos (Figura 1).
Protocol
1. Dissecação
- Sobre um leito de gelo-molhado, arrefecer uma matriz cérebro de roedores (secções coronais segregados 1 milímetro de intervalo), uma placa de Petri contendo 5 lâminas de barbear, e um bisturi # 11. Num recipiente separado, o local de rotulado 2 ml tubos de microcentrífuga de dimensão em gelo seco.
- O investigador vai escolher o método de eutanásia. Temos resultados reprodutíveis conduzindo uma anestesia muito breve com isoflurano, idealmente, um vaporizador deve ser usado. No entanto, se não estiver disponível, usamos um frasco contendo uma bateria grande plataforma. Com o frasco da bateria localizado em um capuz de ventilação aprovado, colocar uma almofada de gaze isoflurano-saturado abaixo da plataforma e esperar 3-5 minutos para permitir que o isoflurano para saturar o frasco da bateria. Coloque o rato para dentro e para remover a decapitação, logo que o rato perdeu a consciência. Remover rapidamente o cérebro (de preferência em menos de dois minutos), lavar com água fria, e colocar imediatamente na matriz refrigeradas roedor cérebro.
- Um minuto após a posiçãoção do cérebro para a matriz, inserir lâminas de barbear frio para o cérebro arrefecida, começando cerca de 2 milímetros rostral do quiasma se o corpo estriado e nucleus accumbens são desejados para a análise em adição aos núcleos mesencéfalo. Continuar a inserção de lâminas de barbear frio com cada secção 1 milímetro até chegar a meio caminho através da ponte, o escalonamento a colocação de cada lâmina de barbear subsequente, de modo a facilitar a remoção mais fácil de cada lâmina individual.
- Ao retirar a lâminas de barbear, olhar para o início do hipocampo. Quando se está completamente enrolada em torno do mesencéfalo, começam a tomar secções usando a lâmina de bisturi # 11, como ilustrado na Figura 2.
- Imediatamente colocar o tecido dissecado para dentro do tubo de microcentrífuga pré-arrefecido no gelo seco. No rato, à espera de ser capaz de dissecar SN e VTA a partir de um mínimo de dois cortes coronais e um máximo de três. Tecidos loja a -80 ° C até estar pronto para processamento.
2. Análise do tecido: HPLC fou dopamina e seus metabólitos
Para informação completa sobre o equipamento de HPLC e de manutenção, referem-se a análise por HPLC no final do artigo.
- Suavemente homogeneizar o tecido imediatamente após a remoção do gelo seco 0,1 M HClO usando solução gelada 4-EDTA (0,1 M HClO 4 e 0,1 mM de EDTA) 9, que contém N-metil dopamina a uma concentração de 20 ng / mL, que serve como um padrão interno para a recuperação da amostra durante a análise por HPLC. O homogeneizador que usamos é uma Sonifier Branson 150, com a definição em 10% da potência total (1 de 10). Os volumes de sonicação seguintes são recomendadas:
No rato, SN = 250 ul (dissecção unilateral), 400 ul (dissecção bilateral), VTA = 200 (dissecção unilateral) uL, 400 uL (dissecção bilateral).
No mouse, (dissecções bilaterais apenas), SN = 200 ul, VTA = 200 ul. - Após homogeneização, mantenha amostras em gelo seco. As amostras são então centrifuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) a 12.000 rpm para sedimentar a proteína pelete a ser utilizado para determinações de Western blot. Os sobrenadantes são injectados directamente no HPLC. Os volumes de injecção seguintes são recomendados para análise precisa no rato ou mouse: (. A partir de qualquer prep) SN = 150 (. A partir de qualquer prep), VTA = 160 ul
- O padrão de reserva é preparado a 1 mg / ml pela adição da quantidade apropriada de monoaminas e metabolitos * do componente de dopamina para 0,1 M de ácido perclórico 0,1 mM de EDTA. A concentração de cada composto é de 1 mg / ml, excepto triptofano que é de 5 mg / ml. O padrão de reserva é dividido em alíquotas de 10 ul e armazenado na ultralow até serem necessários.
* Todos os pesos são corrigidos para a forma de sal do composto, se aplicável.
Preparar o padrão de trabalho por diluição de uma alíquota de 10 ul de padrão de reserva a 100 ml da solução de ácido perclórico. A concentração do padrão de trabalho é de 0,1 ug / ml, excepto triptofano que é de 0,5 ug / ml. 50 ul deeste padrão de trabalho é injectado no HPLC para uma quantidade em coluna de 5 ng de cada componente, excepto triptofano que é 25 ng. - Determinação da recuperação de dopamina dentro alíquota de amostra:
Existem vários passos envolvidos para determinar a recuperação da dopamina a partir de uma alíquota de amostra. - Em primeiro lugar, dividir a altura do pico da amostra dopamina pela altura do pico do padrão de dopamina e multiplicar esta razão pela quantidade total (ng) de dopamina no padrão. A nossa concentração de dopamina padrão é de 0,1 uL ng / uL e 50 do padrão é ensaiada. Assim, a quantidade de dopamina no padrão é de 5 ng. Assim, a equação abaixo pode ser usado para a recuperação de dopamina determinada numa dada amostra:
(Altura do pico de dopamina em amostra / altura de pico de dopamina no padrão) * 5 ng - Corrigindo para a perda de amostra usando o interna dopamina N-metil padrão:
A recuperação efectiva de N-metil dopamina é calculado da mesma maneira como a dopamina, dividindo o dop N-metilamina altura do pico da amostra pela altura do pico de N-metil dopamina do padrão e multiplicando este rácio pela quantidade total (ng) de N-metil dopamina no padrão. Assim como a dopamina, a concentração de dopamina padrão N-metil é de 0,1 ng / uL. 50 uL do padrão é ensaiada. Assim, a quantidade de N-metil dopamina no padrão é de 5 ng. Assim, a equação abaixo pode ser usado para determinar a N-metil recuperação de dopamina numa dada amostra:
(N-metil altura de pico de dopamina no amostra / N-metil altura de pico de dopamina no padrão) * 5ng
No entanto, porque a dopamina N-metil em cada amostra não provém da amostra em si, mas a partir do buffer de HPLC, a quantidade de N-metil dopamina esperado em cada amostra é calculada. A concentração de dopamina N-metilo em HPLC de tampão é de 20 ng / mL ou 0,02 ng / uL, então a quantidade esperada de N-metil-dopamina em cada amostra é obtida multiplicando a concentração de dopamina N-metil do buffer de HPLC por volume da alíquota de cada amostra utilizada para a HA análise do PLC. Isto é demonstrado na equação abaixo:
(0,02 ng / uL) * (volume da alíquota de amostra utilizada para a análise de HPLC) - A diferença entre o esperado e recuperado dopamina N-metil pode então ser usada para corrigir o para a quantidade de dopamina recuperado por ajuste para qualquer perda de amostra. Simplesmente assumir a proporção de dopamina N-metil-esperado / recuperado N-metil-dopamina e multiplicar esta pela quantidade de dopamina recuperado. Assim, a equação geral para a quantidade de dopamina no uma alíquota de amostra é dada abaixo:
(Altura do pico de dopamina na amostra / dopamina altura do pico no padrão) * (N-metil altura de pico de dopamina no padrão / N-metil altura de pico de dopamina na amostra) * (0,02 ng / uL) * (volume da alíquota de amostra utilizada para análise por HPLC ) - Dopamina total recuperado a partir de uma amostra:
O valor de dopamina recuperado a partir de uma alíquota de amostra é então usado para extrapolar a quantidade total de dopamina numa dada amostra. Isto é feito através da divisão do montante recuperado (ng) of DA ao volume da alíquota e multiplicando este valor pelo volume total de tampão de HPLC que a amostra foi sonicada dentro Este é dada pela equação abaixo:
(Montante (ng) de dopamina no alíquota / volume de alíquota de amostra) * (volume total de tampão de HPLC em que amostra foi sonicada).
O leitor é remetido para os seguintes estudos 2,4,10 para uma apresentação global da avaliação da dopamina e metabolitos em conjunto com leituras de dopamina-regulador proteínas, não só na SN e VTA, mas accumbens striatum e do núcleo, bem.
3. Análise do tecido: Normalização Proteína e Final Total de Resultados TH e DAT
- Colocar os peletes de proteína precipitada (derivado do tratamento de tampão HPLC) em gelo para manter húmida a 4 ° C. Garantir que todas as tampão foi removido e arquivado (se a análise de confirmação é necessária). Se o SN ou VTA é para ser processado bilateralmente (rato apenas), adicionam-se 300 uL (SN) ou 200 uL (VTA) de SDS a 1% contendo 5 mM de Tris (pH 8,3) e EDTA 1 mM para o sedimento e sonicado. Adicionar 150 uL da solução de SDS a SN peletes ou 100 ul de peletes VTA se o processamento de tecidos a partir de dissecações unilaterais.
- Colocar as amostras em água em ebulição próximo para ~ 5 minutos para completar a desnaturação de proteínas e deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente. Garantir tampas são firmemente mantida a esta etapa.
- Determinar a concentração de proteína nas amostras utilizando o ensaio de BCA, incluindo uma curva padrão de proteína (padrão albumina) gama de 2-40 ug de proteína. Ensaio de volume uL 5 da amostra, em triplicado e utilizar o valor da mediana para determinar a quantidade de proteína contra a curva padrão. Dividir pelo volume de ensaio para a concentração de proteína. Note que este é o primeiro de dois passos tomados para normalizar TH total, DAT, e VMAT2 resultados para a recuperação de proteína total.
- Preparar as amostras com tampão de amostra (contendo ditiotreitol) para a redução SDS-electroforese em 10% de acrilamida gels. Idealmente, a concentração final de proteína total deve ser ~ 2 ug / uL. A razão para esta selecção concentração é reduzir o volume de amostra necessário para a determinação final da fosforilação TH, como ~ ug de proteína total de 100 será necessário para o carregamento para uma quantificação precisa ser31 e ser40 fosforilação TH. Se a cor amarela é visto na amostra após a adição de tampão de amostra, a amostra é muito ácida. Adicionar 1 M de Tris (pH 8,2) em incrementos de 10 uL até que a cor azul é restaurado.
- Preparar as amostras da seguinte forma para as seguintes determinações de dopamina proteínas reguladoras:
- TH: contra um padrão calibrado para a proteína TH (como ng), a concentração de TH (como por TH ng por proteína ug total) no SN deverá variar de ~ 0,05-0,27 TH ng por proteína total de 2,4 ug, 7,10,11. Contra uma curva linear padrão TH, variando de 0,5-5,0 ng TH e usando o anticorpo primário para TH (Millipore Cat # AB152, diluição 1:1000 em PVP T-20 Solução de bloqueio), que produz uma curva linear padrão, a carga óptima de proteína total a partir do SN deve ser ~ ug 10. A concentração de TH no VTA varia de ~ 0,4-1,0 ng por TH proteína ug 4,11. Assim, a carga de proteína total para VTA deve ser ~ ug 5.
- DAT: As quantidades relativas de DAT em SN ou VTA são significativamente menos do que nas regiões terminais cognatas de campo de striatum e do núcleo accumbens 4. A expressão relativa da DAT como normalizada para a proteína TH recuperado é também significativamente mais baixa em SN e VTA. Por conseguinte, as cargas de proteína para a quantificação de proteína DAT em SN ou VTA precisam de ser muito maior em comparação com as cargas de amostra das regiões de campo de terminais. Um mínimo de 30 ug de proteína total é necessária para a precisão em DAT avaliação em VTA e uma carga nominal de 50 ug de proteína total é necessidade de avaliação no SN. O anticorpo primário utilizado é o Santa Cruz, cat # sc-1433.
- VMAT2: A expressão de VMAT2, Como normalizada para proteína total, é maior do que nas regiões mesoaccumbens nigroestriatal. No entanto, em relação à expressão TH, expressão VMAT2 é maior na SN, pelo menos em estriado e 4. Usando Santa Cruz cat # sc-15.314, uma carga de proteína total nominal de ~ 40 ug ser o melhor para a quantificação de VMAT2.
- Executar a quantidade apropriada de proteína total utilizando SDS-PAGE em géis de acrilamida a 10%. O Bio-Rad Protean unidade de electroforese II é utilizado para as determinações, o que é um formato de gel em grande. Transferir as proteínas para nitrocelulose 0,45 tamanho de poro iM. Para a transferência, um tanque de Hoeffer definida como pelo menos 27 Volts permite a transferência ter lugar ao longo da noite.
- Permitir que as manchas para secar durante pelo menos 30 minutos e em seguida a mancha com solução Ponceau S (1% Ponceau S em 5% de ácido acético glacial) para ~ 5 minutos. De-mancha vigorosamente com 0,2% de solução de HCl até bandas de proteínas individuais claramente resolver e coloração de fundo é removido. Obter uma imagem do S Ponceau manchaing utilizando J imagem para quantificar ainda mais as cargas relativa de proteína em cada pista e normalizar TH, DAT, ou VMAT2 resultados (Figura 3).
4. Análise do tecido: Site-specific fosforilação TH
A fosforilação de TH em ser31 ou ser40 pode aumentar a biossíntese de L-DOPA em células catecolaminérgicos 12. Embora a quantidade de fosforilação em cada local necessário para aumentar a biossíntese de L-DOPA em regiões do cérebro dopaminérgicos como SN e VTA não está estabelecida, há evidências de que ser31 fosforilação desempenha um papel significativo na regulação de L-DOPA biossíntese 10 e co-varia com DA teor de tecido entre o corpo estriado, núcleo accumbens, SN, e VTA 2, 10. No entanto, a inclusão de ser40 determinações são necessárias, como inúmeros estudos mostram que pode afetar a atividade TH, particularmente se um limiar de fosforilação é atingido 12.
Enquanto ser19 phosphorylatiem não afecta a actividade TH sozinho 13,14, ele pode ser considerado um sentinela para Ca 2 + dependente de sinalização no neurónio DA, dado que extracelular Ca 2 + é necessário aumentar a ser19 fosforilação sob condições despolarizantes 12. Além disso, há uma correlação positiva significativa de ser19 fosforilação com ser31 fosforilação apenas no SN e VTA 10, significando que ser19 estado de fosforilação pode afectar ser31 fosforilação, e assim indirectamente a biossíntese de L-DOPA.
Considerações sobre a amostra de carga para quantificação ideal de site-specific estequiometria fosforilação TH: Abaixo, as considerações necessárias para a determinação precisa e precisa de site-specific fosforilação TH em tecidos dissecados é apresentado. Quando possível, um padrão de fosforilação calibrado TH deve ser incluído na avaliação da fosforilação TH amostra. A carga de amostra deve ter em account estequiometria inerente em cada local de fosforilação de modo que o ensaio de fosforilação quantifica dentro da gama dinâmica de trabalho do anticorpo a ser utilizado. Como nota final, a proteína total de inerente entrando no ensaio para cada amostra deve ser também colocado nas pistas curva padrão. Isto é facilmente conseguido com uma proteína transportadora (tais como fígado de rato) que não expressam TH.
- . ser19 Dos três sítios de fosforilação, ser19 níveis de fosforilação estequiometria são maiores na SN e VTA, variando 0,15-0,25 2,10,11. A outra consideração é que pelo nosso método de detecção, ser19 ps é quantificada em faixa linear entre 0,5 e 5,0 ng fosfo-ser19 10. Tendo em conta estas considerações, uma carga de proteína total TH entre 5 e 10 ng (dando assim uma estimativa 0,75 - 2,5 fosfo-ser19 ng a partir da amostra) proporcionaria uma medida fiável da ser19 fosforilação TH. Usamos Phosphosolutions primário (Cat. # p1580-19) em diluição 1:1000.
- ser31. ser31 níveis de fosforilação estequiometria são comparativamente menos na SN e VTA em relação às suas regiões terminais cognatos de campo, que vão desde ~ 0,04-0,10 2,4,10,11. Pelo nosso método de detecção, ser31 ps é detectado no intervalo linear entre 0,5 e 7,0 ng fosfo-ser31 10. Tendo em conta estas considerações, uma carga de proteína total TH entre 10 e 30 ng (dando assim uma estimativa 0,50 - 3,0 ng fosfo-ser31 a partir da amostra) proporcionaria uma medida fiável da fosforilação ser31TH. Ver Figura 4A para um exemplo de ser31 quantificação. O nosso anticorpo primário é um in-house anticorpo purificado por afinidade, que foi fabricado por 21 Biochemicals st Century, (Boston, MA), e validado para a especificidade do epítopo fosfo-utilizando os nossos os padrões internos da 2.
- ser40 ser40 níveis de fosforilação estequiometria em SN e VTA faixa de ~ 0,02 -. 0,06 2,4,10,11. Pelo nosso método de detecção, ser40 ps é detectado no intervalo linear entre 0,2 e 2,0 ng fosfo-ser40 10. Tendo em conta estas considerações, uma carga de proteína total TH entre 10 e 30 ng (dando assim uma estimativa 0,20 - 1,8 ng fosfo-ser40 a partir da amostra) proporcionaria uma medida fiável da fosforilação ser40TH. Veja figura 4B para um exemplo de ser40 quantificação. Usamos Phosphosolutions primário (Cat. # p1580-40) em diluição 1:1000.
5. Os resultados representativos
- Dopamina no SN vs VTA Existem três leituras de dopamina (ou metabolitos) que podem ser tomadas em análise quantitativa;. Como por total recuperado a partir de dissecção, por proteína, e por proteína TH (demonstrada para estriado, SN, núcleo accumbens e VTA na Tabela 1 abaixo). Recuperação de dopamina total entre SN e VTA é bastante comparáveis, variando entre 6-9 ng por duas a três dissecações corte coronal 2. Normalizar recuperação de dopamina para proteína total irá mostrar that, com base no método de dissecação empregue, que o VTA terá maior dopamina por proteína total, em média 6-8 proteína ng / mg em SN e 9-10 ng / mg de proteína em VTA 2, 4. Finalmente, a normalização da dopamina para TH total recuperado deve também revelam uma diferença entre SN e VTA, sendo maior no VTA 10, e que varia entre 0,2 e 0,8 ng de proteína de dopamina por TH ng entre as duas regiões 2,10.
DA região DA total recuperado DA por mg de proteína DA por TH ng striatum 214 ± 16 165 ± 13 0,56 ± 0,11 SN 8,4 ± 0,8 6,1 ± 0,5 0,18 ± 0,03 Núcleo accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0,77 ± 0,03 VTA 6,0 ± 1,0 9,2 ± 1,4 0,22 ± 0,03 - Proteínas totais: TH, DAT, VMAT2 Usando o padrão de proteína TH calibrado para a quantificação, mais TH é recuperada na SN do que o VTA da dissecção (60 ng no SN e 26 ng na VTA 2). No entanto, quando normalizada para a proteína, esta relação inverte, com TH por proteína total na VTA de ser ~ 3 - a 5 vezes maior do que no SN, (proteína ~ 0,32 ng / mg em VTA e ~ 0,09 em SN) 4, 10.
A recuperação prevista DAT em SN e VTA é semelhante, com a recuperação de um pouco mais no VTA como por proteína total ou como por TH total recuperado 4. Notavelmente, a proteína DAT é muito menos abundante nestas regiões em comparação com as regiões terminais cognatas campo 4 VMAT2 recuperação como por proteína total é maior no VTA contra SN 4. No entanto, quando normalizada para a proteína TH, há recuperação ligeiramente maior no SN 4. - Site-specific fosforilação TH De um número de estudos, tem havido resultados consistentes em ser19, ser31, e ser40 quantidade fosforilação no SN e VTA, e também em relação às regiões de campo cognatas terminais. Ser19 fosforilação é notavelmente maior no SN e VTA (~ 0,2-0,3) em comparação com estriado e núcleo accumbens (~ 0,05-0,15) 2,4,7,10,11. Ser31 fosforilação é significativamente menor no SN e VTA em comparação com as suas regiões de campo cognatas de terminais, sendo ~ 0,06-0,10 entre estas regiões somatodendritic 2,4,7,10,11. Durante a inibição da descarboxilase de ácido aromático com a NSD-1015, há um aumento de 2 vezes na ser31 fosforilação no VTA apenas 10. Ser40 varia de fosforilação entre 0,02 e 0,05 na SN eVTA e, geralmente, presente estequiometria não difere significativamente a partir das regiões terminais cognatas de campo 2,4,7,10,11.
Figura 1. Leituras dopaminérgicos de uma dissecção de tecidos.
Figura técnica de dissecção 2. Para isolar o neuropil mesencéfalo dopaminérgica. Técnica para dissecar substantia nigra (SN) da área tegmental ventral (VTA). 1. Remover córtex e hipocampo sobrejacente (estas estruturas já foram removidos na imagem acima). 2. Fazer um corte vertical que separa a área pigmentada do SN da ATV. 3. Fazer um corte horizontal na ou perto da linha média logo acima da parte mais dorsal e lateral do SN. 4. Provoque o SN longe do resto do tronco cerebral. Uma vez que SN foi removido, de forma semelhante provocar o VTA longe doresto do mesencéfalo. Nota: esta secção é tipicamente observado nas coordenadas, em relação ao bregma, na AP 5,7.
Figura 3. Segunda (e última) normalização da proteína total de coloração-carga Ponceau S para análise J Imagem. Coloração Ponceau S proteína de uma determinação TH total em amostras de ratos substantia nigra. Os primeiros cinco pistas formar a esquerda são a curva de TH padrão total, para o qual a proteína ug 28 a partir de homogenato de fígado de rato foi adicionado ao espelhar a carga de proteína a partir das amostras substantia nigra. A pista ao lado contém peso molecular (MW) marcadores. As pistas restantes contêm ~ proteína a partir de amostras de ratos 28μg substantia nigra. As cargas de proteína baseiam-se na concentração de proteína de cada amostra, tal como determinado pelo método de BCA. No entanto, apesar do que deve ser cargas iguais, existem variações na escuridão da coloração Ponceau S entre as amostras que indicam uma ligeiravariabilidade nas concentrações de proteína, que é corrigida por normalização utilizando análise ImageJ para analisar a quantidade de coloração Ponceau S para cada amostra.
Figura 4. Os resultados representativos TH fosforilação de controles e tratamentos. Representante ser31 hidroxilase tirosina fosforilada (PTH) e PTH ser40 borrões ocidentais de salinas e metanfetamina ratos Wistar tratados a partir de um estudo anterior 4. A. Ser PTH 31 em amostras de ratos substantia nigra. Os calibrados servi 31 de PTH gamas da curva padrão a partir de 0,3 ng a 2,0 ng e está dentro da gama linear de detecção. Com base em análise de mancha anterior ocidental de níveis de TH totais, 6 ng de TH total foram carregados para cada amostra. B. ser40 PTH em ratos ventral tegmental amostras. Os calibrados ser40 PTH gamas da curva padrão a partir de 0,2 ng a 1,5 ng e está dentro da gama linear de detecção. Com base em análise de mancha anterior ocidental de níveis de TH totais, 9 ng de TH total foram carregados para cada amostra.
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Discussion
Conforme descrito na Figura 1, os métodos descritos acima devem produzir leituras múltiplas de dopamina e da sua regulação TH proteínas, DAT e VMAT2 a partir de uma amostra de SN ou VTA obtido a partir de qualquer um rato ou ratinho. Novamente, os benefícios de levar a cabo este protocolo são que o investigador pode obter leituras operacionalmente-combinados de como a dopamina é regulada in vivo sob virtualmente qualquer paradigma experimental e, ao fazê-lo, salvo significativas meios experimentais, reduzindo o número de animais necessários em qualquer experimento.
É absolutamente imperativo que o investigador observar os requisitos de temperatura impostas durante a dissecção (4 ° C), o armazenamento de tecido (pelo menos -70 ° C), sonicação tecido (sonicação imediato após a remoção da temperatura de armazenamento) em tampão gelado e HPLC formação de grânulos subsequente e de processamento. Uma vez que o pelete é sonicada e fervidas em solução de SDS, as amostras podem continuar a ser Further processado à temperatura ambiente. O armazenamento de HPLC arquivados analisados amostra e as amostras de tampão de amostra preparadas para análise da proteína deve ser a -80 ° C.
Novamente, a grande vantagem do protocolo é a abordagem inata para operacionalmente-match resultados relativos à regulação de dopamina in vivo. Além disso, normalizando leituras tecido de dopamina para marcadores de neuropil dopaminérgico (TH, DAT) fornecem uma grande medida de garantia de que o investigador é dissecando SN ou VTA com consistência e precisão. Dado o envolvimento de dopamina na doença, a dependência psiquiátrica, e arenas de locomoção, este protocolo pode ser empregado em muitos experimentos. Uma limitação notável é que a interpretação dos resultados de fosforilação TH deve ser conservador, uma vez que não é conhecido neste momento a extensão em que um aumento na fosforilação em ser31 ou ser40 é necessária in vivo para aumentar a biossíntese de L-DOPA. No entanto, como mencionado, existe evdência que ser31 fosforilação parece regular a biossíntese de L-DOPA e tem um papel na regulação do teor de tecido total de dopamina no SNC 2,10. Neste momento, os padrões de proteína TH e fosforilação TH não estão comercialmente disponíveis. No entanto, este laboratório tem mantido e ampliado tais normas baseadas nas usado quando o primeiro trabalho sobre regulação TH fosforilação in vivo foi publicado 11. Ainda assim, é possível para normalizar teor de tecido de dopamina para proteína TH recuperado nestas regiões discretas utilizando este protocolo.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O financiamento para a esse trabalho, e como citado 2,10, foi fornecido, em parte, por uma premiação de pesquisa para concessão MF Salvatore da Federação Americana para Pesquisas sobre o Envelhecimento, Edward P. A Stiles Trust Fund e da Fundação de Pesquisa Biomédica da Northwest Louisiana, e BS Pruett da Sociedade Muslow Ike predoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
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The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
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The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
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The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
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Pump: Shimadzu LC-10AD |
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| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
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| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
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Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
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References
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