Summary

Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Published: December 18, 2012
doi:

Summary

La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.

Abstract

Modelos de animales pequeños tales como ratones se han utilizado ampliamente para estudiar las enfermedades humanas y para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas. A pesar de la riqueza de la información obtenida de estos estudios, las características únicas de la inmunidad ratón, así como la especificidad de especie de las enfermedades virales tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) condujo al desarrollo de modelos de ratones humanizados. Los modelos anteriores implicaban el uso de C. B 17 scid / scid ratones y el trasplante de timo fetal humano y el hígado fetal denominadas tu / liv (SCID-hu) 1, 2 o la transferencia adoptiva de leucocitos de sangre periférica humanos (SCID-huPBL ) 3. Ambos modelos se utilizaron principalmente para el estudio de la infección por VIH.

Una de las principales limitaciones de estos dos modelos es la falta de reconstitución estable de las células inmunes humanas en la periferia para que sean un modelo fisiológicamente más relevantes para estudiar la enfermedad del VIH. Con este fin, el zumbido BLTmodelo de ratón anized fue desarrollado. BLT es sinónimo de médula ósea / hígado / timo. En este modelo, de 6 a 8 semanas de edad NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) ratones inmunocomprometidos recibir el implante tu / liv como en el modelo de ratón SCID-hu sólo para ser seguido por un segundo humana trasplante de células madre hematopoyéticas 4. La ventaja de este sistema es la reconstitución completa del sistema inmunológico humano en la periferia. Este modelo ha sido utilizado para estudiar la infección por VIH y la latencia de 5-8.

Hemos generado una versión modificada de este modelo en el que usamos modificado genéticamente las células madre hematopoyéticas (HHSC) para construir el implante de tu / liv seguida de la inyección de transducidas autólogas HHSC 7, 9. Este enfoque resulta en la generación de linajes genéticamente modificados. Más importante aún, este sistema adaptado para examinar el potencial de generar células funcionales T citotóxicos (CTL) que expresan un receptor específico de melanoma de células T. Utilizando este modelo hemos sido capaces de evaluar la funcionalidad de nuestro CTL transgénico utilizando emisión en directo positrones (PET) para determinar la regresión del tumor (9).

El objetivo de este protocolo es para describir el proceso de la generación de estos ratones transgénicos y evaluación de la eficacia in vivo usando imágenes de PET en vivo. Como nota, ya que utilizamos los tejidos humanos y vectores lentiviral, nuestras instalaciones se ajustan a las directrices del CDC NIH para el Nivel de Bioseguridad 2 (BSL2) con precauciones especiales (BSL2 +). Además, los ratones sin garantía soberana están severamente inmunocomprometidos por lo tanto, su vivienda y mantenimiento deben cumplir con los más altos estándares de salud ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Generación de ratones BLT La generación de ratones BLT se divide en tres (3) partes: (1) de procesamiento de tejido fetal y preparación de células CD34 humanos madre hematopoyéticas, (2) el trasplante de tejido humano, y (3) trasplante secundario. Para todos los protocolos, hemos proporcionado la Tabla 1 con información reactivo. 1. Procesamiento de tejidos y aislamiento de células troncales humanas CD34 hematopoyéticas <p class="jove_c…

Representative Results

Un diagrama de flujo del proceso de trasplante se muestra en la Figura 1A. Una imagen del implante tu / liv se muestra en la Figura 1B. El tejido del timo se desarrolla normalmente y tiene una distribución fisiológica de CD4 humano y las células T CD8. Tras la reconstitución, los animales llevan un sistema inmunitario humano con distribución normal de CD4, CD8 células T y otros linajes celulares inmunes. La discrepancia entre el tamaño del tumor y el …

Discussion

El modelo de ratón humanizado modificado BLT junto con in vivo PET son herramientas poderosas para estudiar enfermedades humanas crónicas. Este sistema toma el modelo de ratón BLT y lo hace avanzar más allá de las limitadas posibilidades de investigación del VIH. Además, es un gran sistema en el que puede examinar diversos protocolos de terapia génica, así como técnicas de diagnóstico antes de que puedan alcanzar el entorno clínico. Esto último, junto con el bajo coste de la utilización de ratones…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Alvin Pang Larry Welch y por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de adjudicación P50 CA086306, el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) subvenciones RC1-00149-1 y RS1-00203-1; CIRM Premio Facultad Nueva RN2-00902-1 , el Caltech-UCLA Conjunto Centro de Medicina Traslacional, UCLA Center for AIDS Research (CFAR) NIH / NIAID AI028697, la UCLA AIDS Institute, las Herramientas CIRM y el Premio de Tecnología RT1-01126, y el Programa multicampus UC Investigación e Iniciativas de la California Centro para el Descubrimiento de Medicamentos Antivirales (número MRPI-143226).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
PBS Invitrogen 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove’s 12440061
Fetal Calf Serum 16000085
Collagenase type IV Sigma Aldrich C5138
Hyaluronidase H3506
DNAse I Roche Diagnostics 10104159001
Piptazo (Zosyn) Pfizer Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus) Ge Healthcare Life Sciences 17-1440-02
MACS Buffer Miltenyi Biotech See comments MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit 130-046-702
LS Columns 130-042-401
Retronectin Takara T100A
Matrigel BD Biosciences 354263
Isofluorane Baxter http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl) Pfizer Animal Health https://www.rimadyl.com/default.aspx

References

  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
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  4. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
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  6. Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
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Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, S. G., Levin, B., Liu, W., Radu, C. G., Kitchen, S. G., Zack, J. A. Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model. J. Vis. Exp. (70), e4181, doi:10.3791/4181 (2012).

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